CTLA4基因多态性与Graves病的关系

李晓丽,孙卫华,吴晨辰,赵文娣,张晓梅

(蚌埠医学院第一附属医院内分泌科，安徽蚌埠 233000)



论著·临床研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.011

CTLA4基因多态性与Graves病的关系

李晓丽,孙卫华,吴晨辰,赵文娣,张晓梅△

(蚌埠医学院第一附属医院内分泌科，安徽蚌埠 233000)

[摘要] 目的 探讨细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)基因单核苷酸多态(SNP)rs10197319、rs1024161、rs231726、rs231804与弥漫性毒性甲状腺肿(Graves)病的关系。方法 以中国安徽蚌埠地区698例Graves病患者(Graves病组)和571名健康体检者(对照组)作为研究对象。应用TaqMan探针技术，分别检测两组的CTLA4基因SNP rs10197319、rs1024161、rs231726、rs231804基因型；同时检测Graves病患者促甲状腺激素受体抗体(TRAb)水平。结果 在4个SNP位点中，rs1024161_A与Graves病易感性显著相关(P=2.28×10-5，OR=1.43，95%CI：1.21～1.68)；Logistic回归分析提示rs1024161是Graves病的独立易感位点。在rs1024161_AA、rs1024161_AG、rs1024161_GG 3种基因型间比较，血清TRAb水平及其他临床表现的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CTLA4基因上rs1024161与中国安徽蚌埠地区汉族人群Graves病明显相关，并且是一个独立易感位点。

格雷夫斯病；CTLA4基因；受体，促甲状腺激素释放激素；多态性，单核苷酸

[Abstract] Objective To investigate the associations between CTLA4 gene polymorphisms at positions rs10197319,rs1024161,rs231726,rs231804 and Graves′ disease(GD).Methods The subjects in this research consists of 698 cases of GD patients and 571 healthy controls from Bengbu city.Genotyping of the four SNPs rs10197319,rs1024161,rs231726,rs231804 was performed using a TaqMan PCR assay;meanwhile,serum concentrations of thyroid stimulating hormone receptor antibody(TRAb)of the patients were also detected.Results Among the four SNPs,rs1024161_A was significantly associated with GD in the Chinese Han population(P=2.28×10-5，OR=1.43，95%CI:1.21-1.68).Logistic regression suggested that rs1024161 was an independent susceptibility locus of GD.Furthermore,serum TRAb concentration and the other clinical features didn′t reach statistical significance among rs1024161_AA,AG and GG genotypes(P>0.05).Conclusion The rs1024161 in CTLA4 gene was significantly associated with GD in the Chinese Han population from Bengbu city,and it may function as an independent susceptibility locus of GD.

弥漫性毒性甲状腺肿(Graves)病，是一种常见的器官特异性自身免疫性疾病，影响着约0.50%～1.30%的西方人群，0.25%～1.09%的中国人群[1]。Graves病的发病机制尚未完全明确，一般认为Graves病的易感性由遗传和环境共同决定[2]，在感染、精神创伤等因素作用下，诱发体内的免疫功能紊乱，这些因素共同作用于T细胞、B细胞，导致抗原识别和递呈的调节紊乱，使之产生了针对促甲状腺激素受体的自身刺激性抗体，从而引起甲状腺功能亢进。细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA4)是许多自身免疫性疾病的共同易感基因，如Graves病、糖尿病、自身免疫性Adison病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。其中，CTLA4基因与Graves病相关联已在不同的国家、地区、种族的人群中得到验证。目前，关于CTLA4基因多态性的研究报道多局限于以下单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism，SNP)位点：启动子区的-318C/T(rs5742909)、第1个外显子+49A/G(rs231775)、第1个内含子+1 822C/T(rs231779)和3′非翻译区的CT60A/G(rs3087243)。全基因组关联研究及扩大样本验证该基因包括多个多态性位点[3]，其中包括本研究所验证的SNPs位点rs10197319、rs1024161、rs231726、rs231804。目前，该基因上真正的致病、易感SNP位点，尚未完全清楚，为此，本研究对中国安徽蚌埠地区汉族人群Graves病患者CTLA4基因上SNPs位点rs10197319、rs1024161、rs231726、rs231804作了进一步的研究，以探讨CTLA4基因与Graves 病及其临床表型的关系。另外，已有报道证实促甲状腺激素受体抗体(thyroid stimulating hormone receptor antibody，TRAb)阳性与促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor，TSHR)基因有关[4]，但TRAb阳性是否与CTLA4基因相关联，国内这方面的研究较少，本研究亦对其进行阐述。

1 资料与方法

1.1 一般资料 Graves病组698例来自于2009年3～10月在蚌埠医学院第一附属医院就诊的Graves病患者，其中男131例(18.8%)，女567例(81.2%)，平均年龄(39.24±14.40)岁。Graves病诊断依据：除有(1)高代谢症状和体征；(2)甲状腺弥漫性肿大；(3)血清游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、血清游离甲状腺素(FT4)或三碘甲腺原氨酸(T3)、血清四碘甲腺原氨酸(T4)增高，(TSH)减低的表现之外，还需要具有以下条件之一：(1)浸润性突眼；(2)TRAb阳性；(3)胫前黏液性水肿[5]。甲状腺肿大程度依体格检查分为0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ度，Graves病眼征分级采用1977年美国甲状腺协会(ADA)提出的分级标准分为0～6级[6]，复发与否结合病史回顾和临床资料，以正规临床治疗治愈半年后是否再次出现甲状腺功能亢进表现来界定。对照组571例，为本院健康体检中心体检者，其中男114例(20.0%)，女457例(80.0%)，平均年龄(44.47±13.94)岁，甲状腺功能正常且无甲状腺疾病史和自身免疫性甲状腺疾病家族史，个体之间无亲缘关系，性别匹配，年龄大于或等于40岁(以排除迟发型自身免疫病患者)。两组均为中国汉族人群。研究方案经蚌埠医学院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法 (1)采集临床资料：如性别、年龄、发病年龄、甲状腺肿大程度、突眼程度、复发与否等；(2)基因组DNA提取：采集研究对象外周血2 mL，枸橼酸钠抗凝。使用Fujifilm QuickGene-610L机器及全血DNA提取试剂提取DNA，用Nanodrop8000(Thermo公司)进行DNA浓度测定，样本DNA纯度A260/A280 1.8～2.0。进一步将样本DNA浓度稀释到50 ng/μL用于基因分型；(3)CTLA4基因上SNPrs10197319、rs1024161、rs231726、rs231804基因分型：其TaqMan探针由美国ABI公司合成，使用Fluidigm96x96 Dynamic Array在Fliudigm EPL平台上进行PCR反应、基因分型与检测；(4)血清指标的测定：收集研究对象外周静脉血3 mL离心分离血清，用免疫化学发光法对Graves病患者血清甲状腺激素进行测定。用TSHR ELISA酶标试剂盒(英国RSR公司)测定患者血清TRAb水平，并以1.5 U/L为界，分为阳性组(≥1.5 U/L)和阴性组(<1.5 U/L)。

2 结 果

2.1 CTLA4基因上4个SNPs基因分型结果及与Graves病发病的相关性 对照组、Graves病组的CTLA4基因的4个SNP的基因型和等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.33、0.44、0.98、0.45)，提示样本具有群体代表性。在4个SNP中，rs1024161_A与Graves病易感性显著相关(P=2.28×10-5，OR=1.43，95%CI：1.21～1.68)，其余3个SNP无明显差异性(P>0.05)；rs1024161基因分型得到AA、AG、GG 3种基因型，A等位基因相对于G等位基因的OR值为1.43，A为易感基因，G为保护基因，Graves病组AA基因型频率显著高于对照组(47.40% VS.32.20%，P<0.01)；Graves病组rs1024161_A等位基因频率显著高于对照组(69.48%VS.61.47%，P<0.01)，可见Graves病组携带易感等位基因的比例高，见表1。

2.2 CTLA4基因上4个SNP基因的Logistic回归分析 以Graves病为因变量，以rs10197319、rs1024161、rs231726、rs231804为自变量进行Logistic非条件逐步回归分析，结果显示rs1024161是Graves病的一个独立易感位点(P=7.99×10-7)。

2.3 Graves病组rs1024161不同基因型与临床资料的比较 按照rs1024161_AA、rs1024161_AG、rs1024161_GG的3种基因型分为3个亚组，分析Graves病rs1024161基因型与患者临床资料的相关性。经χ2检验结果显示rs1024161不同基因型与性别、血清TRAb水平、甲状腺肿大程度、眼征、复发与否的相关性均无统计学意义(P>0.05)。单因素方差分析结果显示rs1024161不同基因型与发病年龄也无明显相关性(P>0.05),见表2。

a:P<0.01，与对照组比较。

表2 Graves病组患者rs1024161不同基因型与临床资料的比较

续表2 Graves病组患者rs1024161不同基因型与临床资料的比较

3 讨 论

Graves病是一种常见的器官特异性自身免疫性疾病，其发生与基因和环境因素相互作用有关，一直以来CTLA4基因被认为是Graves病的主要候选基因[7-8]。人类CTLA4基因位于2号染色体长臂3区3带(2q33)，包括4个外显子、3个内含子和1个前导序列。CTLA4启动子与外显子的多态性可影响CTLA4分子的表达，从而影响其生物学功能，如当CTLA4启动子-318位点为胸腺嘧啶，外显子1第49位点为腺嘌呤时，细胞表达的CTLA4水平增高。CTLA4外显子1的多态性还与CTLA4的功能有关，如CTLA4外显子1中G等位基因频率增高，CTLA4抑制T细胞增殖的功能降低，从而促发Graves病和可能导致其他自身免疫性疾病的发生。由此可见，CTLA4基因多态性与CTLA4的表达和功能缺陷相关，参与Graves病的发生。

目前，不同地区、种族的CTLA4基因与Graves病的遗传易感性研究报道并不一致。Yang等[9]对中国汉族人群研究发现CTLA4±t49A/G SNP与自身免疫性甲状腺疾病明显相关。Esteghamati等[10]在对伊朗Graves病患者的研究中发现CTLA4外显子1 +49A/G的G等位基因与Graves病相关，且CTLA4位点是独立于HLA-DRB1和HLA-DQBl之外的独立易感位点，可见，在Graves病相关的易感基因中CTLA4基因的地位更高。但是，Namo等[11]对巴西儿童和成人Graves患者的研究中则发现病例组CTLA4基因外显子1 +49 A/G S～P和正常对照组差异有统计学意义(P>0.05)。在对CTLA4启动子-318位点C/T基因的多态性与Graves病关联的研究中，Han等[12]认为，CTLA4启动子-318位点为T时，启动子活性较高，可以上调CTLA4的表达水平。但是Esteghamati等[10]在伊朗Graves病患者的研究中并未发现此相关性。以上表明不同种族间，CTLA4等位基因易感性存在很大的差别，因此，本研究旨在探讨CTLA4基因多态与中国汉族人群Graves病发生的相关性。

本研究发现Graves病组患者rs1024161_A的频率明显高于对照组，差异有统计学意义(P=2.28×10-5，OR=1.43，95%CI:1.21～1.68)，rs1024161位点A/A基因型携带者对Graves病易感,即G/G基因型携带者Graves病的患病率较低，提示了CTLA4基因上rs1024161位点是中国安徽蚌埠地区汉族人群Graves病发生的易感位点。

TRAb是一种参与Graves病发生的重要的自身抗体，是该病的重要自身免疫指标。Khalilzadeh等[13]对Graves病患者CTLA4外显子1 A/G多态性进行分析，结果提示A/G(49)SNP与TRAb的产生显著相关。Bednarczuk等[14]研究发现CTLA4基因第1外显子位点49处为GG基因型的Graves病患者体内TRAb水平较高。但Chen等[15]在对中国广东省镇江地区汉族人群的研究发现Graves病患者CD40-1C>T 和CTLA4+6230G>A多态性与血清TRAb水平无明显相关性。本研究也未发现病例组血清TRAb水平与rs1024161_AA、rs1024161_AG、rs1024161_GG基因型之间有关联。国外研究发现TRAb由机体识别自身抗原TSHR诱导产生[16]，而CTLA4和TSHR均为Graves病的主要候选基因，作者推测rs1024161_AA携带者血清CTLA4可溶性A亚基升高，有可能被外周局部淋巴结摄取诱导免疫反应导致TRAb水平增高，但结果与推测不符，可能受本组研究样本量有限及所研究人群的种族、地域环境影响。Graves病的其他临床表现如性别、发病年龄、甲状腺肿大程度、Graves病眼病分级、复发与否在3种基因型之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，尚需要进一步扩大样本量研究以明确其与CTLA4基因多态性的关联性。 综上所述，CTLA4基因是Graves病的一个重要易感基因，其多态性位点rs1024161与中国安徽蚌埠地区汉族人群Graves病发病相关，但CTLA4基因增加Graves病患病风险的具体机制尚不清楚，有待进一步的遗传学和功能研究，以进一步了解Graves病的发病机制，为Graves病预防和基因免疫治疗提供理论依据。

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The relationship between CTLA4 gene polymorphisms and Graves′ disease*

LiXiaoli,SunWeihua,WuChenchen,ZhaoWendi,ZhangXiaomei△

(DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu,Anhui233000,China)

Graves′ disease；CTLA4 gene；receptor,thyrotropin-releasing hormsne；polymorphism,sing/e nucleotide

安徽省教育厅基金资助项目(KJ2013A187)。 作者简介：李晓丽(1984-)，主治医师，本科，主要从事内分泌代谢方面的研究。△

R581.1

A

1671-8348(2016)28-3922-03

2016-06-11

2016-07-01)