白细胞介素17在IgA肾病中引起IgA1糖基化异常的作用研究

林佳如，樊均明

(1.成都中医药大学中西医结合临床学院 610075；2.西南医科大学附属第一医院肾病内科，四川泸州 646000)



论著·基础研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.006

白细胞介素17在IgA肾病中引起IgA1糖基化异常的作用研究

林佳如1,2，樊均明1,2

(1.成都中医药大学中西医结合临床学院 610075；2.西南医科大学附属第一医院肾病内科，四川泸州 646000)

[摘要] 目的 对Th17细胞的主要细胞因子白细胞介素17(IL-17)参与介导IgA肾病(IgAN)中B淋巴细胞增殖及IgA-1异常糖基化的过程进行初步研究。方法 以体外培养的DAKIKI细胞为研究对象，在剂量效应分析中，以5～320 ng/mL的IL-17作用48 h，在时间效应分析中以160 ng/mL IL-17刺激24、48、72 h，细胞计数法和CCK-8法检测细胞增殖状况，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测DAKIKI细胞培养上清液中IgA1的水平，HAA凝集素检测IgA1糖基化异常程度。结果 CCK-8和细胞计数法显示，5～320 ng/mL浓度范围的IL-17均可明显刺激B淋巴细胞增殖(P<0.05)；ELISA及HAA检测结果显示，与对照组相比，IL-17可引起DAKIKI细胞培养上清液中IgA1水平及异常糖基化的明显增加(P<0.05)。结论 IL-17呈时间和剂量依赖性地刺激B淋巴细胞的增殖和B淋巴细胞分泌IgA1，并且IL-17刺激B淋巴细胞增生的同时，诱导IgA1的低糖基化异常。

白细胞介素17；肾小球肾炎，IGA；B淋巴细胞；糖基化

[Abstract] Objective To investigate the effect of IL-17 on the production and underglycosylation of IgA1 in a B cell line in IgA nephropathy.Methods DAKIKI cells,which was isolated from B lymphocytes and had the function of secretory IgA,was cultured and treated with different concentrations of IL-17(5,10,20,40,160,320 ng/mL)for 48 h,160 ng/mL IL-17 for different times(24,48,72 h).Then the cell proliferation was examined by cell counting and CCK-8.The production and glycosylation of IgA1 in supernatants were determined by ELISA and helix aspersa(HAA)lectin binding assay,respectively.Results The cell counting and CCK-8 results suggested that the 5-320 ng/mL concentration range of IL-17 could significantly stimulate B lymphocyte proliferation(P<0.05).ELISA and HAA test results showed that compared with the control group,IL-17 could cause DAKIKI cell culture supernatant IgA1 content and abnormal glycosylation significantly increased(P<0.05).Conclusion IL-17 can stimulate the B lymphocyte proliferation and secretion of IgA1 in time and dose dependent and accompanied by increased IgA1 production in vitro,while it also induced underglycosylation of IgA1.

IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)是全球范围内最常见的肾小球疾病，其临床表现多种多样，主要表现为血尿，几乎所有患者均表现有血尿。大约25%～50%的患者在疾病诊断后25年内发展到终末期肾衰竭(ESRD)；患者即使接受肾移植，仍有超过50%的患者在肾移植术后2年内IgAN复发。IgAN在欧美国家发病率约为10%，在日本等东南亚地区和澳大利亚其构成比最高为30%～40%[1]。在我国IgAN占原发性肾小球疾病的45.26%，约26.69%的ESRD患者为IgAN所致。IgAN最早被认为是IgA-IgG免疫复合物沉积于肾脏导致的疾病，但是随着研究的深入，人们逐渐认识到糖基化异常的IgA1是引起IgAN的惟一抗体，从而最终形成免疫复合物沉积在肾小球系膜区，引起肾功能损伤[2]。然而，以肾小球系膜区 IgA 沉积为特点的IGA肾病的发生机制尚未完全了解。近年研究发现，IgA1分子糖基化异常在IgAN的发病机制中发挥着关键作用。

Th17细胞是新近发现的一类不同于Th1和Th2细胞的第三类辅助性T细胞亚群，Th17细胞可产生大量的白细胞介素17(IL-17)，Th17细胞介导的绝大多数生物学效应都是通过IL-17起作用。在多发性硬化患者中，IL-17水平增加与病情恶化相关；而在小鼠模型中诱导Th17细胞反应，可促进自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发生。在银屑病中，IL-17 mRNA水平与疾病活动性相关；在类风湿性关节炎中，滑膜中IL-17水平与关节损伤严重程度相关[3]。总之，目前已有大量研究结果均提示Th17细胞可能参与自身免疫性疾病的发生、发展。

同样作为自身免疫性疾病的IgAN，Th17细胞是否也在其自身免疫发病机制中发挥作用，目前尚无相关研究报道。但早在2005年发现Th17细胞以前，Matsumoto等[4-5]、Harrington等[6]报道在表现为肾病综合征的IgAN患者尿液中IL-17水平明显增加；而由IgAN患者体内分离出的外周血单核细胞(PBMC)给予IL-17刺激后，促炎症性细胞因子释放明显增多[4-6]。上述研究结果提示IL-17可能参与IgAN的发病。Lin 等[7]研究发现，在IgAN患者的血清中，IL-17 的表达逐步增多，且IgAN患者血清中 IL-17 的表达水平与24 h蛋白尿呈正相关[7]。以上结果提示IL-17 可能是IgAN免疫发病机制及进展的重要因素之一。本研究进一步探讨Th17细胞及其主要效应因子IL-17参与介导IgAN的分子机制，特别是与IgA1分子糖基化异常相关的生物学机制，从而为IgAN自身免疫发病机制及防治研究提供新的实验证据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 DAKIKI细胞株(ATCC公司，美国)；重组人IL- 17(R&D Systems,公司，美国)；5-Azacytidine(公司，美国)；脂多糖(LPS)、HAA凝集素、辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗ExtrAvidin(Sigma，美国)；胎牛血清(SH30070，Hyclone公司，美国)；RPMI-1640培养基(Gibco公司，美国)；羊抗人IgA抗体、HRP标记羊抗人IgA抗体(Southern Biotechnology Associates公司，美国)；神经氨酸酶(Roche，德国)；CCK-8试剂盒(KGA317，凯基生物科技发展有限公司，中国)；多功能酶标仪(Infinite M200，TE-can公司，瑞士)；紫外分光光度仪(Nano Drop ND1000，Thermo Fisher,美国)。

1.2 方法 探讨IL-17对DAKIKI细胞的增殖，以及刺激IgA1分泌及糖基化异常的机制，并进行剂量[IL-17组(观察组)：5、10、20、40、80、160、320 ng/mL)、时间(测定3个时间点，分别为24、48、72 h)]依赖分析。

1.2.1 CCK-8法检测细胞增殖 根据实验要求，待刺激结束后，每孔加入CCK-8试剂10 μL；将培养板置于37 ℃孵育2 h后，酶标仪上450 nm波长处检测光密度(OD)值。

1.2.2 酶联吸附免疫法(ELISA)检测IgA1浓度 通过包被一抗、封闭、加样(每孔加入50 μL，设置3个重复孔)、孵育二抗、显色后在10 min内用酶标仪在450 nm波长处读取OD值。所有的OD值减去空白孔的OD值再进行计算，以标准品的浓度为横坐标及所测得的OD值为纵坐标，利用Curve Expert软件绘制标准曲线；再根据标准曲线计算样品的IgA1浓度。

1.2.3 HAA凝集素结合试验检测IgA1低糖基化程度 通过包被一抗、封闭、加样(每孔加入50 μL，设置3个重复孔)、神经氨酸酶处理、孵育二抗、显色后在10 min内用酶标仪在450 nm波长处读取OD值。

2 结 果

2.1 IL-17对B淋巴细胞的增殖作用

2.1.1 细胞计数检测IL-17对B淋巴细胞增殖影响 在剂量依赖实验中，用5～320 ng/mL的IL-17刺激培养B淋巴细胞48 h，细胞计数结果显示：与对照组(未添加IL-17刺激)比较，不同浓度的IL-17均可促进B淋巴细胞的增殖，但320 ng/mL较160 ng/mL组效果好，见表1。在时间依赖实验中，采用160 ng/mL的IL-17分别刺激培养B淋巴细胞24、48、72 h，细胞计数结果显示，与各对应时间点的对照组相比，IL-17组均出现细胞数量明显增多，见表1。

2.1.2 CCK-8检测IL-17对B淋巴细胞增殖的影响 用5～320 ng/mL的IL-17刺激培养B淋巴细胞48 h，CCK-8法检测细胞增殖状况，OD值越高表示增殖细胞越多。检测结果显示，与对照组相比，不同浓度范围的IL-17均可明显刺激B淋巴细胞增殖，见表2。

2.2 IL-17对B淋巴细胞分泌IgA1浓度的影响 在剂量依赖实验中，将5～320 ng/mL的IL-17刺激B淋巴细胞培养48 h，采用ELISA的方法检测细胞上清液中IgA1的。ELISA结果用OD值表示，值越高代表上清液中的IgA1浓度越高。由结果可见，B淋巴细胞在5～320 ng/mL的IL-17刺激作用下，IgA1的分泌量出现明显增高，并随IL-17浓度的增加呈现明显的剂量-效应关系，见表1。在时间依赖实验中，采用160 ng/mL的IL-17刺激B淋巴细胞培养24、48、72 h，分别与同一时间点的对照组细胞进行比较。ELISA结果显示，细胞培养上清液中IgA1的浓度在24 h时无明显变化(P>0.05)，随着时间的延长，在48 h和72 h时出现明显增高(P<0.05)，见表2。

表1 时间依赖实验中160 ng/mL、IL-17不同作用时间对B淋巴细胞增殖作用、分泌IgA1能力及IgA1异常糖基化作用的影响

a:P<0.05，b:P<0.01，与对照组比较。

表2 剂量依赖实验中不同剂量IL-17对B淋巴细胞增殖作用、分泌IgA1能力及IgA1异常糖基化作用的影响±s)

a:P<0.05，b:P<0.01，与对照组比较。

2.3 IL-17对B淋巴细胞分泌的IgA1糖基化的影响 在剂量依赖实验中，采用HAA凝集素结合实验检测细胞上清液中IgA1的丰乳糖基转移酶(GalNAc)结合凝集素的能力，OD值越高表示IgA1分子的低糖基化程度越高。结果显示，与对照组比较，5 ng/mL的IL-17对IgA1分子的糖基化异常影响差异无统计学意义(P>0.05)，10～320 ng/mL的IL-17均可明显促进IgA1的低糖基化(P<0.05)，在160 ng/mL时达到了峰值，随后进一步提高IL-17浓度，IgA1的低糖基化反而出现一定程度的下调，见表1。在时间依赖实验中，作者采用160 ng/mL的IL-17刺激B淋巴细胞培养24、48、72 h，每组与同一时间点的对照组比较，HAA凝集素结合实验结果显示，在24、48 h组上清液中IgA1的浓度均较同一时间点的对照组高(P<0.01)，但在72 h组上清液中IgA1的浓度与差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

3 讨 论

IgAN是世界范围内尤其是亚洲地区最常见的导致慢性肾衰竭的原发肾小球疾病之一。其发病涉及遗传、免疫等多种复杂因素，机制尚未完全明了。IgAN病理是以系膜区IgA沉积为特征的系膜增生性肾小球肾炎，IgAN的始发因素是系膜区IgA的沉积，其主要为多聚IgA1(pIgA1)沉积，伴或不伴IgG、 IgC3沉积。众多研究已证明IgAN患者血清、肾小球系膜区及尿液的循环免疫复合物中均存在异常糖基化IgA 分子[8-10]。

而引起低糖基化IgA1分子形成的原因主要是由于糖基化酶异常可产生N-乙酰半乳糖胺末端半乳糖基化通过细胞内半乳糖基转移酶[主要是β-1,3 半乳糖基转移酶(C1GALT1)]催化，且需其伴侣蛋白Cosmc的辅助，最终由唾液酸酶催化半乳糖唾液酸化形成糖链。研究发现在IgAN患者的PBMC、扁桃体组织及扁桃体B淋巴细胞中C1GALTl及其伴侣蛋白Cosmc的蛋白表达水平及基因表达水平都是降低的[11-13]。同时，扁桃体B淋巴细胞的C1GALTl基因表达水平和IgAN患者的临床表现[如肾小球滤过率(GFR)、蛋白尿及组织损伤评分等]是显著相关的[11]。在笔者的早期研究中也发现IgAN患者外周血中B淋巴细胞Cosmc mRNA表达水平显著低于对照组，且与蛋白尿成负相关，提出IgAN患者lgAl O-糖基化异常可能是外周血B淋巴细胞Cosmc mRNA表达下降所致，外周血B淋巴细胞Cosmc mRNA表达下降可能是IgAN发病机制之一[14]。

IL-17是一种强大的前炎性细胞因子，也是炎性反应的微调因子，可促进中性粒细胞和单核细胞的募集，引起炎症细胞浸润和组织损伤，参与肾脏炎性反应的发生和发展[15]。笔者将IL-17刺激B淋巴细胞后发现，IL-17可促进B淋巴细胞的增殖且呈时间和剂量依赖性，并且在促进B淋巴细胞增生的同时还引起低糖基化异常的IgA1分泌增多。因此在IgAN患者的体内，产生糖基化异常的IgA1分泌增多的原因可能是由于外源性抗原如各种病毒、 幽门螺旋杆菌引起Th17细胞的分泌增多，导致IL-17分泌增加，从而引起B淋巴细胞增生及低糖基化异常的IgA1分泌增多，沉积到肾脏引起疾病的发生。

综上所述，IL-17可诱导B淋巴细胞增殖，且作用随浓度梯度而增加，大剂量有一定细胞抑制作用。IL-17能诱导B淋巴细胞分泌IgA1。IL-17呈时间和剂量依赖性诱导B淋巴细胞分泌低糖基化的IgA1。

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Effects of IL-17 in IgA nephropathy induced underglycosylation of IgA1

LinJiaru1,2,FanJunming1,2

(1.ClinicalCollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610075,China；2.DepartmentofNephrology,theFirsAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,LuZhou,Sichuan646000,China)

inteleurin-17；glomerular nephlitis,IGA；B lymphocytes；glycosylation

林佳如(1988-)，在读博士，主要从事IGA肾病发病机制以及中医药治疗慢性肾脏病的相关研究。

R692.6

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1671-8348(2016)28-3907-03

2016-06-18

2016-07-06)