冠脉宁口服液干预ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的实验研究

罗 文，张三林



冠脉宁口服液干预ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的实验研究

罗 文，张三林

目的 探讨冠脉宁口服液对ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)动脉粥样硬化病变(AS)的影响及其机制。方法 30只以C57BL/6J为背景的10周龄ApoE-/-小鼠，高脂饲料喂养12周后随机分为3组：模型组、冠脉宁组、复方丹参组，每组10只。冠脉宁组给予冠脉宁口服液20 g/(kg·d)灌服；复方丹参组给予复方丹参溶液3.5 g/(kg·d)灌服；模型组给予等量生理盐水灌服。另设10只相同背景和周龄的普通饲料喂养的C57BL/6J小鼠作为空白对照组。分别给药12周后小鼠摘除眼球采血，酶法检测血脂水平，ELISA方法检测血清中内脏脂肪素(visfatin)、白介素-6(IL-6)水平。HE染色观察小鼠主动脉病理形态学变化。结果 空白对照组主动脉未见动脉粥样硬化改变，模型组有较明显的主动脉内膜增厚及粥样斑块的形成。模型组血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平及血清中visfatin、IL-6的表达显著高于空白对照组，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平则显著低于空白对照组(P<0.05)。与模型组比较，冠脉宁组、复方丹参组TC、TG、LDL-C水平及血清中visfatin、IL-6水平显著降低(P<0.05)，而HDL-C水平显著升高(P<0.05)，且病理损伤程度减轻。冠脉宁组与复方丹参组比较，血脂指标、visfatin、IL-6水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 冠脉宁口服液可降低ApoE-/-小鼠的血脂水平及血清中visfatin、IL-6水平，具有一定的抗动脉粥样硬化作用，可能通过调节血脂代谢、降低炎症细胞因子水平达到抑制动脉粥样硬化进展、稳定动脉粥样硬化斑块的目的。

动脉粥样硬化；ApoE基因；内脏脂肪素；白介素-6；冠脉宁口服液

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是引起冠心病的病理基础，已经成为导致人类死亡的首要病因。已有大量的证据表明：脂质代谢和炎症反应异常与动脉粥样硬化的发生发展有着密切的关系[1]，因此降脂和抑制炎症反应能更有效地抑制AS病变的发生发展。

临床研究表明：冠脉宁口服液对冠心病心绞痛有较显著的疗效，并能有效改善生化指标，具有抗AS、调节脂代谢的作用[2]。本研究通过高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠制备动脉粥样硬化模型，观察冠脉宁口服液对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的干预作用，探讨其改善AS进程及稳定斑块的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只10周龄雄性ApoE-/-小鼠，品系C57BL/6J，体重18 g～20 g，10只相同遗传背景和周龄的雄性C57BL/6J小鼠，体重18 g～20 g，均购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(苏)2011-0003。高脂饲料(2.0%胆固醇，2.5%猪胆盐，10.0%猪油加入小鼠标准饲料中混匀)由常州卡文斯实验动物有限公司提供。

1.2 试验药物与试剂 冠脉宁口服液，批号济联制字(2001)FP10024(21)，中国人民解放军第三七一医院提供。复方丹参片，批号Z44023372，广州白云山和记黄埔中药有限公司生产。血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒，购自北京中生北控生物科技股份有限公司；内脏脂肪素(visfatin)ELISA试剂盒(批号：AK0015FEB02001)购自Elabscience公司；白细胞介素-6(IL-6)ELISA 试剂盒(批号：00604)购自晶美生物工程有限公司，美国Oriono Diagostica公司生产。

1.3 仪器 德国Thermo酶标定量测定仪；瑞士罗氏公司COBAS EMIRA 型全自动生化仪；Eclipse Ti荧光倒置显微镜，日本尼康公司。

1.4 造模、分组与给药 将30只ApoE-/-小鼠分5只1笼饲养于新乡医学院河南省医用组织再生重点实验室动物房内，经普通饲料适应性喂养7 d后给予高脂饲料，连续喂养12周后随机分为3组：模型组、冠脉宁组、复方丹参组，每组10只。冠脉宁组给予冠脉宁口服液20 g/(kg·d)灌服；复方丹参组给予复方丹参溶液3.5 g/(kg·d)灌服；模型组给予等量生理盐水灌服。另设10只相同遗传背景和周龄标准饲料喂养的C57BL/6J小鼠作为空白对照组。

1.5 标本采集与处理 12周后停止药物干预，结束实验。所有小鼠禁食12 h，眼球摘除法获得血液标本，经3 000 r/min离心10 min后，取上清液，冻存于-20 ℃冰箱保存。酶法检测小鼠血清血脂水平，ELISA法检测血清visfatin含量。小鼠处死后打开胸腔，剪开心包，暴露心脏，由心尖部灌注生理盐水5 min，再灌注4%多聚甲醛5 min行主动脉固定。自主动脉根部至腹主动脉末端分离整条主动脉，将主动脉组织投入新鲜配制的4%多聚甲醛固定液中在4 ℃冰箱过夜，次日置换缓冲液。取横切面的小鼠主动脉标本，常规经脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋处理后制作病理切片。每张切片厚5 μm，每间隔8张取1张做HE染色，进行组织病理学观察。

2 结 果

2.1 小鼠一般情况 在造模、药物干预期间各组小鼠均无死亡；对各组小鼠摄食情况观察发现：模型组、冠脉宁组、复方丹参组小鼠在药物干预期间饮食量减少(约每只6 g/d高脂饲料)，饮水正常；空白对照组小鼠实验期间正常饮食、饮水(约每只10 g/d标准饲料)；对各组小鼠活动能力及灵敏度观察：与其他组比较，冠脉宁组小鼠明显表现出较强的活动能力和较高的反应灵敏度；各组小鼠实验结束后体重均有一定程度的增加。模型组、冠脉宁组、复方丹参组、空白对照组体重增加值分别为(7.07±2.47)g、(4.67±0.85)g、(4.42±1.26)g、(3.96±1.31)g，各给药组小鼠体重增加值均低于模型组(P<0.05)，冠脉宁组与复方丹参组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组小鼠血脂指标的变化 模型组TC、TG、LDL-C水平显著高于空白对照组，而HDL-C水平则显著低于空白对照组(P<0.05)。与模型组比较，冠脉宁组、复方丹参组TC、TG、LDL-C水平显著降低(P<0.05)，而HDL-C水平显著升高(P<0.05)，冠脉宁组与复方丹参组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组小鼠血脂水平比较(±s) mmol/L

2.3 各组小鼠血清visfatin水平的变化 与空白对照组比较，模型组血清visfatin、IL-6水平明显增高(P<0.05)；与模型组比较，冠脉宁组、复方丹参组血清visfatin、IL-6水平降低(P<0.05)；冠脉宁组与复方丹参组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

ng/mL

2.4 各组小鼠主动脉病理形态学改变 空白对照组C57BL/6J小鼠主动脉中膜平滑肌细胞排列规则，主动脉壁内膜较薄，结构完整，内膜下无脂质沉积，未见泡沫细胞形成等动脉粥样硬化改变(图1A)。各组ApoE-/-小鼠主动脉壁存在不同程度的动脉粥样硬化病灶形成。其中模型组可见中膜平滑肌细胞增生并且排列紊乱，主动脉内膜增厚、内皮细胞部分脱落，动脉粥样硬化斑块体积较大，大量泡沫细胞形成和堆积，突向管腔，管腔明显狭窄(图1B)。冠脉宁组和复方丹参组AS 病变较模型组显著减轻，两组动脉壁仍可见明显的内膜增厚和动脉粥样斑块形成，但斑块面积明显减小，内膜相对平整，斑块中可见少量空泡及增生细胞形成，中膜下有少量细胞增生，中膜平滑肌排列相对规则(图1C、图1D)。

注：A为空白对照组；B为模型组；C为冠脉宁组；D为复方丹参组。

图1 各组小鼠主动脉病理观察(免疫组化，×200)

3 讨 论

近年来，越来越多的研究证实：炎症反应和脂质代谢异常在AS的发生发展中起着重要的作用，并且贯穿于AS斑块的形成、生长到破裂的全部过程。内脏脂肪素是一种近几年新发现与炎症和代谢综合征有关的脂肪组织分泌的细胞因子[3]。visfatin具有多种生物学活性，如参与炎症反应应答、诱导血管生成、延缓中性粒细胞凋亡、调节脂代谢等[4]。多名学者临床研究发现，冠心病病人血清visfatin水平显著升高，且冠心病病变程度愈重，visfatin 水平愈高，是独立于已知冠心病危险因素的又一新的危险因素[5-6]。Dahl 等[7]进一步研究发现：visfatin 大量表达于动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞中，可能参与斑块发展进程，故建议将PBEF/visfatin作为介导心血管病改变的炎症因子。

IL-6是近年来研究较多的一种多效应细胞因子，能趋化、活化中性粒细胞和单核细胞，促进血管内皮细胞表达黏附分子和其他炎症递质，增强局部的炎症反应。目前有研究显示酪氨酸激酶JAK/STAT信号可能是AS发生发展重要通路[8]，而机体重要的炎症因子IL-6调控的STAT3信号系统是其中主要的炎症通路[9-11]。AS不稳定斑块中富含炎症介质以及含剩余游离胆固醇巨噬细胞。游离胆固醇在巨噬细胞内的堆积可以导致炎症因子IL-6的分泌[12]。IL-6介导的白细胞黏附增加促进斑块的不稳定性，削弱了斑块处的纤维帽，加速斑块裂隙，IL-6可刺激基质降解酶的合成，侵蚀斑块内的基质，最终导致斑块破裂，并介导血栓形成[13]，是大多数急性冠脉综合征发生的主要原因[14-15]。

中医认为本病病机为本虚标实，所谓本虚是指气血阴阳虚弱，标实多为气滞血瘀、痰浊内阻，标实多在本虚基础上发展而来，多相互影响，但基本病机为气虚血瘀，气虚血瘀是发病关键，贯穿本病发病的全过程，大多数学者强调益气活血化瘀为本病基本治疗方法[16]。以益气活血为治则的中成药冠脉宁口服液重用黄芪益气升阳固本、三棱活血化瘀、薤白祛湿化痰，三药合用，益气活血、理气止痛、祛湿化痰，标本兼治。有资料报道[2]：黄芪有扩张冠状动脉血管、抗心肌缺氧及缺血/再灌注所致损伤，可改善心肌代谢，降低能量消耗，维持氧的供求平衡，提高心肌耐缺氧能力，保护心肌细胞超微结构，降低血黏度，有单用黄芪治疗冠心病取得较好疗效，可改善预后、预防复发。三棱可改善微循环，抗凝、抗血小板聚集，降低血液黏度。薤白具有抗单核细胞与血管内皮细胞黏附的作用，其机制可能是通过抑制内皮细胞表面黏附分子的表达，降低血浆内皮素(ET)水平，升高血浆一氧化氮(NO)浓度，降低血脂和促进血小板活化有关。

本研究结果表明：冠脉宁口服液可降低ApoE-/-小鼠的血脂及血清中visfatin及IL-6水平，减少动脉粥样硬化斑块面积，降低血管狭窄度，其可能通过调节血脂代谢、降低炎症细胞因子水平达到抑制动脉粥样硬化进展、稳定动脉粥样硬化斑块的目的，其调控炎症反应的具体分子机制值得今后进一步的研究。

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(本文编辑郭怀印)

Experimental Research of Guanmaining Oral Liquid on Atherosclerosis in Apolipoprotein E Gene Knockout Mice

Luo Wen，Zhang Sanlin

Xinxiang Medical University，Xinxiang 453000，Henan，China Corresponding Author：Zhang Sanlin

Objective To explore the effects and its mechanisms of Guanmaining oral liquid (GOL) on atherosclerosis(AS) in apolipoprotein E gene knockout mice(ApoE-/- mice).Methods Totally 30 C57BL/6J genetic background ApoE-/- mice which were 10 weeks old were fed a high fat diet for 12 weeks until the formation of a mature atherosclerotic plaque.They were randomly divided into three groups:model group，GOL group，compound salvia miltiorrhiza group，10 mice in each group.Another 10 wild-type normal C57BL/6J mice were used as the blank control group.They were administered for 12 weeks.Blood was extracted from the bulbus oculis.The serum lipid contents were observed with enzyme method.visfatin and interleukin-6 (IL-6) level were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).HE-stain was used to observe aortic pathomorphological changes.Results The blank control group showed no distinctive changes of atherosclerosis，the model group had distinctive increase of aortic intima thickness and atherosclerotic plaque formation.The model group also had high serum levels of total cholesterol(TC)，triglyceride(TG)and low-density lipoprotcin(LDL)，as well as high visfatin and IL-6 expression .However，high-density lipoprotein(HDL)in the model group was lower than the blank control group(all P<0.05).Compared with the model group，the serum levels of TC，TG，LDL-C were decreased.Visfatin and IL-6 expression were lowered(P<0.05)，while HDL-C was increased(P<0.05)in Guan maining group and compound salvia miltiorrhiza group，degree of pathological damage was reduced.There was no significant difference in above-mentioned indicators between GOL group and compound salvia miltiorrhiza group(P>0.05).Conclusion GOL could decrease the serum levels and the expression of visfatin and IL-6 of ApoE-/-mice.It can inhibit the development of atherosclerosis by regulating serum lipids，suppressing inflammation factors，which is the possible mechanism of stabilizing the atherosclerotic plaque.

atherosclerosis；apolipoprotein E gene knockout mice；visfatin；interleukin-6；Guanmaining oral liquid

河南省重点科技攻关计划项目(No.132102310408)

新乡医学院(河南新乡 453000)

张三林，E-mail：zsl196293@163.com

R543.5 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.19.010

1672-1349(2016)19-2240-04

2016-02-09)

引用信息：罗文，张三林.冠脉宁口服液干预ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的实验研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(19)：2240-2243.