番茄防御酶活性与番茄抗白粉病相关性研究

马高龙

摘 要：植物在病害或者环境胁迫条件下会产生酶促性的保卫性生化反应，酶活性测定表明：未接种番茄幼苗中，各品种PAL活性无明显变化，接种白粉菌后抗病品种和感病品种的PAL活性均有升高；未接种番茄幼苗中各品种间酶活性无明显变化，接种白粉菌后抗病品种的POD活性迅速升高，表现出对病菌侵染强烈的应激变化，而感病品种升高缓慢；未接种番茄幼苗叶片中，各品种间酶活性无显著差异，且都变化趋势不明显；接种白粉菌后抗病品种的PPO活性迅速升高，表现出对病菌侵染强烈的应激变化，而感病品种升高趋势相对缓慢。

关键词：番茄白粉病；番茄防御酶；抗病性；相关性

一、材料和方法

1.材料

（1）白粉菌来源。2012年10月份，采自湖北省荆州市长江大学西校区日光温室番茄白粉菌带回室内，接种健康感病番茄品种里格尔87-5植株上扩大繁殖，备用。

（2） 供试品种。根据2007年对64个加工番茄品种对白粉病抗性的田间调查结果，挑选高抗品种钻石、TOM0629D，耐病品种Z00-73、3379，感病品种里格尔87-5和高感品种3144等6个品种，种子均由甘肃省高台中化番茄制品公司提供。

2. 方法

（1） 番茄幼苗的培养和接种方法。选用无病种子，种植在装有灭菌土的塑料营养钵中，每品种种50钵，每钵6粒。放在温室或培养室培养，于4～6叶期将发病叶片上的分生孢子扫落或抖落到健康植株叶片上，并保湿48h，每品种接种35钵（其中15钵用于测定酶活性，20钵用于调查统计发病率和病情指数），15钵喷清水作对照，并隔离培养。分别在接种前、接种后0.5d、1d、2d、4d、7d和10d检测各品种处理和对照的酶活性，并于病害特征明显后（高感品種发病率达到50%时），调查统计各品种发病率和病情指数。

（2）酶液提取及活性测定

① POD和PPO活性检测方法。实验所需化学试剂：0. 05mol/l磷酸缓冲液（PH为5.5）； 0.05mo1/1愈创木酚溶液；2%的双氧水溶液；0. lmol/1的儿茶酚溶液；20%三氯乙酸溶液。实验仪器用：精密数显恒温水浴锅；精密酸度计；分光光度计。

实验步骤：（1）粗酶液的制备，煎取5g叶片，剪碎后放入早置于冰浴中预冷过的研钵中，加入适量的磷酸缓冲液后研磨成匀浆，将匀浆完全转入离心管中后在3000r/min转速下离心l0min，上清液转入25m1容量瓶中，定容后在低温下保存备用。（ 2 ） POD活性的测定，取3支试管，依次加入2. 9m10. 05mo1/1的磷酸缓冲液；1.0m12%的H2O2；1m10.05mo1/1的愈创木酚溶液，将其中一支试管在沸水中煮5min为对照。作两组重复实验，检测体系在加入酶液后立即于37℃水浴中保温1 Smin，然后迅速转入冰浴中，立即加入2.0m120%三氯乙酸溶液终止反应，然后将反应混合溶液在5000r/min转速下离心10min，适当稀释后在分光光度计上470nm波长下检测吸光值。（ 3 ） PPO活性检测与POD基本相似，只是反应体系为3.9m1磷酸缓冲液；1 ml儿茶酚和0.1 ml酶液，水浴中的反应时间为10min，在525nm波长下检测吸光值。

酶活力计算：以每分钟在该波长下变化0.01为1个酶活力单位，计算公式如下：酶活力（U）=△A×D/0.01×wt单位为：U/gfw

②PAL活性测定。取供试番茄叶片1 g，加PVP 0.1 g，5 mM巯基乙醇硼酸缓冲液4 mL和少量石英砂于研钵中研磨成匀浆，4℃下8000 r/min离心15 min，取上清液0.1 mL，加底物0. 02 M苯丙氨酸硼酸缓冲液（pH8.8）3 mL，蒸馏水2.9 mL，30℃保温30 min，对照以蒸馏水代底物，290 nm比色，以每min在290 nm处吸收变化0.01所需酶量为一单位（相当于每毫升反应液中形成1μg肉桂酸）。

二、结果与分析

1.供试品种间PAL（苯丙氨酸解氨酶）活性与白粉病抗性的关系

（1） PAL活性的在品种间的动态变化。PAL活性测定结果表明， 未接种番茄幼苗中，各品种PAL活性无明显变化，接种白粉菌后抗病品种和感病品种的PAL活性均有升高，并且均出现两个峰值，第一个峰值出现在0.5d～1d，此峰幅度均小，最高为134.70U/g·h FW（高抗品种TOMO629D，0.5d），比其对照平均值升高24.3%；第二峰均在第7d，此峰幅度较大，高抗品种TOMO629D酶活性最高（186.40 U/g·h FW），比其对照均值升高72.1%。接种第10d呈下降趋势，除两个高抗品种外，其余品种PAL活性均接近对照。

（2） PAL活性与供试品种抗病性的关系。将各品种对照10d内变化值平均后与病情指数做相关分析，结果显示显著水平p>0.05，即相关性不显著；将各品种第7d酶活性与病情指数做相关分析后，结果显示p<0.05，说明品种抗病性越高。第7d的PAL活性就越高，反之则越低；将第7d的增幅与病情指数做相关分析，结果显示p<0.05，说明品种抗病性越高7d的酶活性增幅就越大，反之就越小。将后二者进一步做回归分析，得回归方程及回归曲线。

2.供试品种间POD（过氧化物酶）活性与白粉病抗性的关系

POD活性与供试品种抗病性的关系。将各品种对照10d内变化平均后与病情指数做相关分析，结果显示显著水平P>0.05，即相关性不显著；将各品种第7d酶活性与病情指数做相关分析后，结果表明各品种第7d的酶活性与其病情指数有显著的负相关性；将第7d的增幅与病情指数做相关分析，结果表明各品种第7d的增幅与其病情指数有显著的负相关性。将后二者进一步做回归分析，得回归方程及回归曲线。

3.供试品种间PPO（多酚氧化酶）活性与白粉病抗性的关系

（1）PPO活性的在品种间的动态变化。PPO活性测定结果表明， 未接种番茄幼苗叶片中，各品种间酶活性无显著差异，且都变化趋势不明显；接种白粉菌后抗病品种的PPO活性迅速升高，表现出对病菌侵染强烈的应激变化，而感病品种升高趋势相对缓慢，但都在第0.5d（品种3144在第1d）形成一个峰值，高抗品种钻石PPO活性最高（30.29U·g-1·min-1），比其对照均值升高109.04%，而感病品种3144仅比其对照均值升高3.03%；随后逐渐下降，到第7d时，感病品种里格尔87-5和3144酶活性下降到与对照相近水平，之后各品种PPO活性又开始上扬。

（2） PPO活性与供试品种抗病性的关系。将各品种对照平均后与病情指数做相关分析，结果显示显著水平p>0.05，即相关性不显著；将各品种第0.5d酶活性与病情指数做相关分析后，结果表明各品种第0.5d的酶活性与其病情指数有显著的负相关性；将第0.5d的增幅与病情指数做相关分析，结果表明各品种第0.5d的酶活性增幅与其病情指数有显著的负相关性。将后二者进一步做回归分析，得回归方程及回归曲线。

三、结论和讨论

1.本试验对番茄感染白粉病后过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶的变化做了研究，结果表明， PAL活性与供试品种抗病性第10d后不显著，第7d相关性较显著。POD活性与供试品种抗病性第10d不显著，第7d有显著负相关性。PPO活性与供试品种抗病性第0.5d有显著负相关性。抗病品种的过氧化物酶活性显著低于感病品种；感病后，感病品种的酶活性升高幅度明显大于抗病品种，说明其与抗病性密切相关，但是否可以作为鉴定番茄品种抗白粉病的生化指标，尚有待于进一步深入研究。

2.苯丙氨酸类代谢是形成多种具有抗菌作用产物的途径之一。有關研究报道，当植物受病菌侵染。后，伴随PAL活性的升高有木质素的积累和植保素的合成，表明PAL的活性与植物抗病性有关。这反映了不同抗性的番茄品种间的抗病基因不同，而PAL活性是抗病基因的一种表达。本试验结果表明，不同抗病品种的PAL活性差异不明显，但是感染白粉病菌后PAL活性的变化与番茄的抗病性呈正相关，即病原菌对抗病品种PAL活性的诱导比感病品种大的多。

参考文献：

[1] 张树生，胡蕾等. 植物体内抗病相关酶与植物抗病性的关系. 安徽农学通报，2006， 12（13）： 48-49.

[2] 蒋选利，李振岐等. 过氧化物酶与植物抗病性研究进展. 西北农林科技大学学报，2001，6（12）：124～129.

[3] 张 欣. 与植物抗病性有关酶的研究进展. 华南热带农业大学学报，2000，1（3）：41～46.