婴幼儿配方粉中牛磺酸的前处理优化及氨基酸分析仪分析

刘旭辉　刘萤　张姗

[摘 要] 对奶粉中牛磺酸的前处理方法、流动相比例和柱温箱温度对氨基酸分析仪测定奶粉中牛磺酸的影响进行研究。结果表明，乙醇沉淀蛋白法能够更好地提取奶粉中牛磺酸；柱温25℃的条件下，用75%pH4.20柠檬酸锂缓冲液B和25%pH8.00柠檬酸锂缓冲液C作为流动相进行梯度洗脱提取牛磺酸，为氨基酸分析仪测定奶粉中牛磺酸较优条件。建立的氨基酸分析仪测定方法，该方法的相对标准偏差为0.62%，回收率为99.6%～101.5%，准确而灵敏，适合婴幼儿配方奶粉中牛磺酸的分析。

[关键词] 牛磺酸；氨基酸分析仪；分离度

中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2016）05-092-03

DOI：10.11876/mimt201605034

牛磺酸（Taurine）是一种含硫的β-氨基乙磺酸[1]。作为生理营养的活性物质，对人体起着十分重要的生理调节作用[2]，尤其在促进婴幼儿大脑和中枢神经系统发育，增强心血管功能以及钙吸收等方面作用突出[3]，是婴幼儿食品重要的营养添加剂。

目前测定牛磺酸的主要方法有分光光度法[4-5]、荧光吸光光度法[6]、高效液相色谱法[7-9]、衍生化高效液相色谱法[10]、自动电位滴定法[11]、傅立叶变换红外线光谱法[12]等，这些方法操作烦琐，操作要求高，比如液相色谱法仪器投入大，分析时间长；柱前衍生法灵敏度高，但操作条件要求高，干扰比较大；分光光度法样品必须通过离子交换柱纯化后才能测定。现有的国家标准GB 5413.26-2010[13]《婴幼儿食品和乳品中牛磺酸的测定》采用的是高效液相色谱法，其中OPA柱后衍生和单磺酰氯柱前衍生法都需要复杂的衍生步骤。

本研究建立了婴幼儿奶粉中牛磺酸测定的氨基酸分析仪测定方法，样品经乙醇沉淀蛋白进行提取，前处理简单，快速，可用于婴幼儿奶粉中牛磺酸的快速定性定量检测，为保证婴幼儿乳品安全提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 样品

婴幼儿配方奶粉：市售，购于北京京客隆超市。

S-433D型氨基酸分析仪：德国Sykam公司，配有带电子制冷功能的溶液存放单元s7130，带电子恒温的自动进样器s5200，含双波长检测器的反应单元s4300，内置在线真空脱气机的四元梯度输液单元；s21003K15型离心机，德国Sigma公司；N-EVAP 116型氮吹仪，美国Organomation 公司；天平：感量为 0.1mg，德国Sartorius公司。

1.2 试剂和耗材

缓冲液A： pH 2.90柠檬酸锂缓冲液；缓冲液B： pH4.20柠檬酸锂缓冲液；缓冲液C： pH8.00柠檬酸锂缓冲液；再生液D： 柠檬酸锂缓冲液；样品稀释液：pH 2.20柠檬酸锂缓冲液、茚三酮溶液均购于北京捷盛依科科技发展有限公司。浓盐酸、无水乙醇、磺基水杨酸固体、异丙醇、甲醇均购于北京中科三环有限公司。异丙醇和甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。玻璃带塞水解管购于北京捷盛依科科技发展有限公司。

1.3 奶粉前处理方法

1.3.1 酸水解法 称取一定量样品，精确到0.0001g，（使样品蛋白质含量在10～20mg范围内）放于水解管内。水解管加6mol/L盐酸10mL，使奶粉全部溶解，摇匀。氮吹10～20s后，立即盖紧瓶盖。于110℃恒温干燥箱内放置水解22h，取出后漩涡振摇，冷却后，在6000转/min条件下离心5min。取上清液0.5mL，氮吹至完全干燥，加2mL样品稀释液复溶，经0.45μm微孔膜过滤，供仪器测定使用。

1.3.2 蛋白沉淀法 称取样品约1.0000g，用0.2%盐酸溶解样品，并定容到10mL，使奶粉全部溶解。取2mL溶解后的试样于10mL容量瓶中，加入无水乙醇（或磺基水杨酸）定容至刻度，静置30min，取样液约2mL放在2mL离心管中，在10000转/min条件下离心5min。取上清液1mL，氮吹至完全干燥，加1mL样品稀释液复溶，经0.45μm微孔膜过滤，供仪器测定使用。

1.4 氨基酸仪测定条件

色谱柱：Sykam LCA K 07/Li，150×4.6mm，LCA K

05/Li，100×4.6mm。流动相：75%缓冲液B和25%缓冲液C。流速：0.4mL/min。柱温：25℃。进样量：50μL。衍生试剂：茚三酮试剂，流速0.25mL/min。冲洗柱子试剂：再生液D，流速0.4mL/min。牛磺酸最大吸收波长在570nm处。

通过改变洗脱条件和柱温箱温度测试牛磺酸的分离度。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的选择

用盐酸水解法对样品进行测试，有杂质峰干扰，分离度较小；已有采用盐酸水解法提取食品中牛磺酸的报道[14]，但在本文的研究中，此方法不适用于奶粉样品的提取。溶解后的样品加入磺基水杨酸沉淀蛋白，蛋白质并不能被完全沉淀，呈絮状；溶解后的样品加入乙醇沉淀蛋白后，取出再加入磺基水杨酸进一步沉淀蛋白（乙醇和磺基水杨酸沉淀蛋白法），牛磺酸峰与杂质峰不能很好分离；溶解后的样品加入磺基水杨酸沉淀蛋白后，取出再加入乙醇进一步沉淀蛋白（磺基水杨酸和乙醇沉淀蛋白法），使得牛磺酸峰与杂质峰分离度有所提高；而用乙醇沉淀蛋白法提取牛磺酸，分离度可达1.24，能够完全满足定量分析的需要。对样品进行回收测试，各前处理方法的回收率在80%～120%允许的区间范围内。表1为不同前处理方法对测定结果的影响，图1为不同前处理方法测定牛磺酸色谱图。

不同的前处理方法对回收率没有太大影响。蛋白质为两性物质，在酸性环境中带正电荷，而磺基水杨酸根带负电，可与蛋白质结合沉淀，磺基水杨酸正好使液体呈酸性，促使二者结合，但磺基水杨酸沉淀效果不理想，多用于沉淀微量蛋白；而乙醇沉淀蛋白法，则是利用乙醇有机相能破坏蛋白质颗粒的水化膜，导致蛋白变性而沉淀，效果比较理想。

2.2 流动相比例的选择

通过改变洗脱条件进行比较，选用100%缓冲液A进行洗脱，杂质峰与牛磺酸峰分离度小于1；选用100%缓冲液B进行洗脱，杂质峰与牛磺酸峰分离度最高达到1.07；选用80%缓冲液B和20%缓冲液C进行梯度洗脱，杂质峰与牛磺酸峰分离度最高达到1.17，分离均不理想；选用75%缓冲液B和25%缓冲液C进行梯度洗脱，杂质峰与牛磺酸峰分离度最高可达到1.24，分离度达到理想值。对样品进行回收测试，回收率在80%～120%允许的区间范围内，不同流动相洗脱比例对回收率没有影响。

缓冲液A液pH为2.90，缓冲液B液pH为4.20，缓冲液C液pH为8.00，由此可得出，用pH比A液偏中性的75%缓冲液B和偏碱性25%缓冲液C一起洗脱，牛磺酸峰与杂质峰分离度达到最好。前处理过程中，氮吹至干后，复溶液选用中性的水比选用酸性的样品稀释液作为复溶液更好。表2为不同流动相对测定结果的影响，图2为不同流动相洗脱后色谱图。

2.3 柱温箱温度的选择

柱温箱温度调节为37℃时，用100%缓冲液A进行洗脱，有杂质峰干扰，分离度较小；温度调节为60℃时，用100%缓冲液A进行洗脱，牛磺酸与杂质峰不分离；温度为37℃时，用75%缓冲液B和25%缓冲液C进行梯度洗脱，有杂质峰干扰，分离度不理想；而柱温箱温度为25℃时，用75%缓冲液B和25%缓冲液C进行梯度洗脱，分离度可达1.24；对样品进行回收测试，回收率在80%～120%允许的区间范围内，不同柱温对样品进行测定对回收率没有影响。

通过改变柱温箱温度，得出温度变化对牛磺酸出峰时间影响不大，而对于杂质峰，温度低出峰时间前移，可与牛磺酸峰分离，实验得出温度在25℃时分离效果最好。表3为柱温箱柱温改变对分离度的影响，图3为柱温改变后的色谱图。

2.4 线性范围与检出线

精确吸取牛磺酸标准溶液0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2.5mL分别加入到10mL容量瓶中，用水定容，进行分析。以响应（峰面积）为Y，浓度为X，绘制线形图。线形方程： Y=287572.52339×X+104.14317。相关系数R2=0.9999910。

2.5 精密度

仪器精密度：配置牛磺酸标准溶液10mg/L，重复测定，计算峰面积的RSD（n=6）为0.39%。

实验方法精密度：取一定量奶粉样品，按乙醇沉淀蛋白法测试牛磺酸含量，重复测定，其测定结果的RSD（n=6）为0.50%。

2.6 加标回收率

取奶粉样品按照乙醇沉淀蛋白法进行牛磺酸含量的测试，再在样品中加入牛磺酸标准品进行测定，测试其回收率，回收率为99.6%～101.5%。

3 结论与讨论

牛磺酸可与茚三酮试剂反应，利用氨基酸自动分析仪检测出其含量。通过改变前处理过程、改变仪器洗脱条件和柱温箱的温度，得出仪器洗脱梯度用比缓冲液A液偏中性的75%缓冲液B+25%缓冲液C作为流动相进行洗脱，温度在25℃时，牛磺酸的分离提取最好。

本文建立的乙醇沉淀蛋白用氨基酸分析仪检测方法，适用于婴幼儿配方粉中牛磺酸的定性定量检测。结果表明本方法前处理简单、分析速度快、准确度和灵敏度较高，可作为婴幼儿配方粉监测手段，为保证我国婴幼儿乳制品的安全提供技术保障。

参 考 文 献

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