杨树环化酶基因组织表达模式和蛋白定位

 贾志刚，夏德安，李淑娟 

（东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江　哈尔滨　150040）

杨树环化酶基因组织表达模式和蛋白定位

贾志刚，夏德安，李淑娟

（东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150040）

半定量RT-PCR显示，毛果杨形成层、幼叶和顶芽中的Potri.006G237100转录产物极低，但在木质部、叶柄和根中其转录水平却较髙，在木质化茎节其转录产物也呈现高丰度积累，这表明Potri.006G237100在毛果杨木质化组织中特异地、高丰度转录表达。实验构建pGWB5-Potri.006G237100载体，转化拟南芥、分子鉴定得到5个过量表达转基因植株，激光共聚焦分析显示融合蛋白Potri.006G237100-GFP定位在转基因植株的细胞质。

环化酶；组织表达模式；Potri.006G237100；蛋白定位；杨树

环化酶是一种催化核苷三磷酸生成环核苷酸的酶，广泛存在于动物、植物、微生物[1]。环化酶编码基因呈现基因家族特征，在植物中存在多种类型，参与植物的多种生物学功能。研究报道，水稻的一类环化酶通过控制活性氧水平参与逆境胁迫[2]。番茄红素ε-环化酶基因过量表达与光合作用有关[3]，番茄红素β-环化酶基因参与小麦β-胡萝卜素生物合成[4]。丙二烯环化酶基因参与作物的耐盐性，过量表达该基因增加水稻在高盐度环境下生物量[5]，这种功能在小麦中也有类似报道[6]。然而，环化酶基因在树木中的研究信息却报道甚少。

在前期研究中分离了一个杨树环化酶基因Potri.006G237100，推测它可能参与木材形成。为了鉴定该基因的功能，采用半定量RT-PCR分析Potri.006G237100的组织中表达特性，及其转录水平与茎木质化程度同步情况。此外，通过融合绿色荧光蛋白GFP策略，分析Potri.006G237100-GFP融合蛋白在转基因拟南芥植株细胞内的定位。以期对今后解析杨树Potri.006G237100在木材形成上作用提供重要的基础信息。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1植物材料从顶端向基部分别取毛果杨第1至第10茎节以及木质部、形成层、韧皮部、幼叶、老叶、叶柄、顶芽和根各组织，用于鉴定目标基因的组织表达特性。Columbia野生型拟南芥即WT作为遗传转化环化酶基因Potri.006G237100所需的拟南芥材料。

1.1.2载体和试剂载体：pENTR/SD/D-TOPO载体、LR Clonase载体、GWB5、pGWB2；主要试剂：植物基因组DNA提取试剂、DNA Marker、dNTP、pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶和PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser试剂盒。

1.2试验方法

1.2.1植物总RNA提取及cDNA合成植物样品材料经液氮速冻、研碎至粉末，移入1.5 mL离心管内，按0.1 g样品加入0.5 mL pBIOZOL试剂，具体操作参照pBIOZOL试剂说明书。用不含核糖核酸酶水溶解总RNA，测定浓度和纯度。总cDNA合成使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser试剂盒，操作步骤参照其说明书。

1.2.2引物设计及序列Potri.006G237100基因所需扩增片段长度为507 bp，引物序列为：cds-UP：5′-ATGG CAGAAGAAACACCACAGAT-3′；cds-DN：5′- ACCC GATAGGA CATC CTGTTCCA-3′。内参基因ACT引物序列为：UP5′-CCCAGTGTTGTTGGTAGGCCA AGAC-3′；DN5′-CATAGCGGGAGAGTTAAAGGTCTC-3′。

1.2.3PCR扩增总体系为20 μL，水13 μL，模板1.0 μL，Taq DNA聚合酶1.0 μL，dNTP 2.0 μL，10×Buffer 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL。PCR反应程序：预变性95℃ 5 min，变性95℃ 30 s，引物退火均为62℃ 30 s、72℃ 30 s，扩增30循环，72℃延伸7 min，16℃保存。1.2.4植物表达载体构建及遗传转化拟南芥取30～60 ng基因片段和pENTR/SD/D-TOPO载体进行连接反应，体系为5 μL、反应时间2 h。取1 μL连接产物转化TOP10感受态细胞，通过菌落PCR扩增进行阳性菌落筛选，并结合DNA测序。将带有目的基因片段pENTR/SD/D-TOPO质粒与pGWB5植物表达载体LR反应，反应体系2.5 μL、反应时间8～12 h，取1 μL连接产物转化DH5α感受态细胞，通过菌落PCR鉴定阳性菌落，重组质粒转化GV3101农杆菌。拟南芥遗传转化用农杆菌蘸花法，操作参见文献[7]。

1.2.5植物基因组DNA提取拟南芥基因组DNA提取方法参见文献[8]。

1.2.6绿色荧光蛋白GFP检测在1/2MS培养基上萌发6 d的幼苗被用于GFP荧光检测。使用Zeiss LSM700激光共聚焦显微镜进行GFP荧光观察和拍照，激发波长设定为488 nm。

2　结果与分析

2.1环化酶Potri.006G237100基因表达分析

为了鉴定杨树Potri.006G237100基因在杨树各组织的表达情况，首先以毛果杨的木质部、形成层、韧皮部、幼叶、老叶、叶柄、顶芽和根组织为模板，用该环化酶基因全长引物进行半定量RT-PCR扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示：毛果杨Potri.006G237100基因在木质部、根、叶柄组织中转录表达水平最高，在韧皮部、老叶组织中转录表达水平低于木质部、叶柄、根组织中的转录表达水平，在形成层、幼叶和顶芽基本没有转录水平表达，同时，使用内参基因ACT作为半定量RT-PCR内标，ACT基因扩增数据显示木质部、形成层、韧皮部、幼叶、老叶、叶柄、顶芽、根组织各样品cDNA模板浓度基本相同（图1A）。

试验通过分析第1至第10茎节中的Potri.006G237100基因转录水平，以进一步确定该基因转录水平与木质化组织相关性。在第1第2茎节处Potri.006G237100基因转录水平几乎检测不到，从第3至第10茎节转录水平逐渐提高（图1B）。由于第1节至第10毛果杨茎节呈现逐渐木质化发育[9]，RT-PCR扩增结果表明：在木质化程度高的茎节中Potri.006G237100基因转录表达水平高，且它的转录表达水平与茎节木质化程度同步。此外，用内参基因ACT作为半定量RT-PCR内参，结果显示各样品cDNA模板浓度基本相等（图1）。

图1　毛果杨不同组织的Potri.006G237100转录表达水平

2.2Potri.006G237100植物表达载体构建

以毛果杨总cDNA为模板，以Potri.006G237100基因全长基因引物进行PCR扩增，经浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到约为500 bp的片段长度（图2A），该片段长度基本符合目的基因片段长度，确定是试验需要的目的片段。片段胶回收后与pENTR/SD/D-TOPO载体连接，得到重组质粒pENTR/ SD/D-TOPO-Potri.006G237100（图2A），经质粒DNA测序表明全长Potri.006G237100基因片段被插入到pENTR/SD/D-TOPO载体上。

通过LR反应将pENTR/SD/D-TOPO载体上Potri.006G237100片段同源重组到pGWB5植物表达载体上，重组质粒pGWB5-Potri.006G237100经琼脂糖凝胶电泳检测（图2B）。以该质粒DNA为模板，加入Potri.006G237100基因引物，PCR扩增产物出现约500 bp特异带，与目标基因片段大小相符（图2B）。这表明Potri.006G237100基因已经与植物表达载体pGWB5融合。由于pGWB5载体带有报告基因GFP，得到Potri.006G237100-GFP基因（C端融合GFP）。

2.3转Potri.006G237100-GFP基因拟南芥鉴定

将Potri.006G237100-GFP基因遗传转化拟南芥，通过卡那霉素筛选得到抗卡那霉素植株5株。为了分析这5个株系是否过量表达Potri.006G237100-GFP基因，提取各株系RNA、反转录成cDNA，通过半定量RT-PCR鉴定Potri.006G237100基因转录水平。结果如图3所示，在未转入外源基因的野生型拟南芥中没有扩增出目的基因带，而在5个转基因植株中均扩增出特异的目的带。以拟南芥内参基因ACT作为半定量RT-PCR内标，ACT基因扩增结果显示野生型与各转基因株系样品cDNA模板浓度基本相同（图3）。PCR循环数显示转基因植株过量表达了目的基因，由此判断，该基因成功转入拟南芥及在转基因拟南芥中呈现出高丰度的转录表达。

图2　pGWB5-Potri.006G237100植物表达载体构建

图3　转Potri.006G237100-GFP基因拟南芥RT-PCR分析

2.4Potri.006G237100-GFP融合蛋白细胞内定位分析

已有数据显示Potri.006G237100特异在杨树木质化组织内表达，其功能应该参与木材（次生细胞壁）形成。鉴于此，试验分析Potri.006G237100-GFP融合蛋白在细胞内定位。用激光共聚焦显微镜检测转基因拟南芥根中GFP荧光信号，结果显示：信号集中在细胞质内，在周质区域也有少量信号分布（图4）。这一结果表明，Potri.006G237100-GFP融合蛋白并没有定位在细胞壁。

图4　转Potri.006G237100-GFP蛋白的细胞内定位

3　结论与讨论

环化酶基因广泛地存在于生物体，在植物中一些环化酶基因被认为参与逆境胁迫[2，5]。研究中RT-PCR数据显示，杨树环化酶基因Potri.006G237100在木质化组织中特异地、高丰度转录表达，特别是在木质部、叶柄、根中高丰度转录表达，相关基因在木质部高丰度表达[10]，而木质部是植物木质化程度发育最快的部位，因此推测Potri.006G237100基因可能与杨树次生生长有关。树木木材是次生组织生长发育形成的，次生壁形成是其中的主要特征。基于这点，分析了该环化酶在细胞内的定位。数据显示Potri.006G237100定位于细胞质内，却不是定位于细胞壁，这一结果暗示这个环化酶可能不是直接参与次生壁形成的。在生物体内环化酶种类较多，其作用的底物种类可能较多，然而其参与的生理功能被了解得很少。要确定杨树环化酶Potri.006G237100是否参与木材形成，敲除该基因、分析其突变体遗传表型无疑是一种非常有效的方式。

[1] 张 霞，范可强，李红玉，等. 芳香聚酮早期后修饰环化酶的结构分类和功能分析[J]. 微生物学报，2010，50（5）：561-567.

[2] Qin Y，Shen X，Wang N，et al. Characterization of a novel cyclaselike gene family involved in controlling stress tolerance in rice[J]. J Plant Physiol，2015，（181）：30-41.

[3] Song X，Diao J，Ji J，et al. Overexpression of lycopene ε-cyclase gene from lycium chinense confers tolerance to chilling stress in Arabidopsis thaliana[J]. Gene，2016，（576）：395-403.

[4] Zeng J，Wang C，Chen X，et al. The lycopene β-cyclase plays a significant role in provitamin A biosynthesis in wheat endosperm[J]. BMC Plant Biol，2015，（15）：112.

[5] Liu HH，Wang YG，Wang SP，et al. Cloning and characterization of peanut allene oxide cyclase gene involved in salt-stressed responses[J]. Genet Mol Res，2015，14（1）：2331-2340.

[6] Zhao Y，Dong W，Zhang N，et al. A wheat allene oxide cyclase gene enhances salinity tolerance via jasmonate signaling[J]. Plant Physiol，2014，164（2）：1068-1076.

[7] Clough SJ，Bent AF. Floral Dip: a simplified method for Agrobacterium mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal，1998，16（6）：735-743.

[8] 徐平丽，赵晋平，孟静静，等. 一种适宜拟南芥PCR检测的DNA提取方法[J]. 农业科学与技术，2010，11（3）：41-42.

[9] Liu JW，Hai GH，Wang C，et al. Comparative proteomic analysis of Populus trichocarpa early stem from primary to secondary growth[J]. J Proteomics，2015，（126）：94-108.

[10] Zhao Y，Song D，Sun J，et al. Populus endo-beta-mannanase PtrMAN6 plays a role in coordinating cell wall remodeling with suppression of secondary wall thickening through generation of oligosaccharide signals[J]. Plant J，2013，74（3）：473-85.

（责任编辑：夏亚男）

Gene Expression Pattern and Subcellular Localization of Populus Trichocarpa Cyclase

JIA Zhi-gang，XIA De-an，LI Shu-juan
（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin150040, PRC）

Semi-quantitative RT-PCR analysis showed that Potri.006G237100 gene transcripts are very low in cambium， young leaf and apical bud of Populus trichocarpa， but high in xylem， petiole and root. Also， high abundance of Potri.006G237100 gene transcripts was detected in lignifying stems. These data suggest that Potri.006G237100 gene is specifically and abundantly expressed in the lignifying tissues of P. trichocarpa. In addition， the DNA fragement of Potri.006G237100 gene was constructed into plant expression vector pGWB5 and transformed into Arabidopsis plant. Five transgenic plants were attained through molecular identification. Confocal laser scanning microscope analysis suggested that Potri.006G237100-GFP fusion protein is located in the cytoplasm of transgenic plants.

cyclase; tissue expression pattern; Potri.006G237100; protein localization; Populus trichocarpa

S792.11

A

1006-060X（2016）10-0001-03

2016-08-01

国家“863”计划课题（2013AA102702）

贾志刚（1989-），男，河北衡水市人，硕士研究生，研究方向为林木遗传育种。

李淑娟