卷丹百合3种主要病毒脱毒方法研究

 周晓波，吴艺飞，丁茁荑，陈立培，李世树，黄丽萍 

（1. 湖南省蔬菜研究所，湖南　长沙　410125；2. 湖南省蔬菜工程技术研究中心，湖南　长沙410125；3. 湖南省湘西自治州龙山县经济信息局，湖南　龙山　416000）

卷丹百合3种主要病毒脱毒方法研究

周晓波1,2，吴艺飞1,2，丁茁荑1,2，陈立培3，李世树3，黄丽萍3

（1. 湖南省蔬菜研究所，湖南长沙410125；2. 湖南省蔬菜工程技术研究中心，湖南长沙410125；3. 湖南省湘西自治州龙山县经济信息局，湖南龙山416000）

为了获得无病毒的优质种苗，以感染CMV、LSV和LRV的卷丹百合珠芽为试材，采用热处理、茎尖培养结合添加病毒唑的方法，运用RT-PCR方法检测病毒，探讨最适宜的脱毒方法。结果表明：对于CMV，仅通过茎尖培养，剥取0.1～0.3 mm大小茎尖培养脱毒率可达100%，但成活率仅为45%；对于LSV，38℃高温热处理20 d后，剥取0.1～0.3 mm茎尖培养，脱毒效果最佳，可达90%以上；对于LRV，38℃高温热处理20 d后，剥取0.4～0.6 mm茎尖培养，添加10 mg/L病毒唑可使脱毒率达90%以上。综合3种病毒的脱毒率和成活率，以38℃高温热处理20 d后，剥取0.4～0.6 mm茎尖培养，添加10 mg/L病毒唑，成活率较高，脱毒效果最好。

卷丹百合；病毒；脱毒方法

卷丹百合（Lilium lancifolium）属百合科百合属，为多年生宿根草本植物。球茎肥大，具有润肺止咳、补中益气、宁心安神的功效[1]，食用价值和药用价值均非常高，受到广大消费者的喜爱。卷丹百合在湖南、安徽和江西等省（区）都有分布，仅湖南龙山县常年种植面积3 400 hm2，是该县农业支柱产业之一[2]。卷丹百合生产上多采用无性繁殖，该技术造成病毒大量累积使植株发生病毒病。主要包括百合无症病毒（lily symptomless virus，LSV）、百合丛簇病毒（lily rosettle virus，LRV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）等[3]，病毒的侵染造成产量下降、品质变劣，制约了百合的发展[4]。因此，当务之急是通过生物技术手段获得百合脱毒苗，从源头上掐断病毒的侵染[5]。 1962年，Phillips最早进行百合脱毒研究，此后，很多专家相继进行相关研究并取得了良好进展[7-11]。目前，仅2012年周晓波等[12]对LSV的脱毒条件进行探索性的报道，前人的研究侧重于百合的组织培养或单一病毒的脱毒方法研究[13-17]，脱毒效果不很理想，在大规模应用上有一定的局限性，对卷丹百合多种病毒脱毒方法进行系统地研究暂未见报。研究分别以感染LSV、LRV和CMV的卷丹百合珠芽为试材，通过热处理、茎尖培养结合添加病毒唑的方法，运用RTPCR方法检测病毒，旨在探讨最适宜的脱毒方法，为繁育优质的脱毒百合种苗提供参考，为百合产业的健康稳定发展提供保障。

1　材料与方法

1.1试验材料

供试材料为湖南省湘西龙山县栽培多年的卷丹百合（均由湖南省湘西龙山县农业局提供）。分别选择具典型感染百合无症病毒（LSV）、百合丛簇病毒（LRV）、黄瓜花叶病毒（CMV）的植株，采集百合珠芽备用。田间试验在湖南省蔬菜研究所完成，室内试验在湖南省工程技术研究中心完成。

1.2试验方法

1.2.1不同脱毒方法对不同病毒的脱毒处理分别以感染CMV、LSV、LRV的卷丹百合珠芽为试材，在流水下清洗去表面的泥土，分别装入200 mL玻璃杯中，上面盖一层打湿的毛巾，放在38℃高温条件下处理不同天数（0、10、20、30 d）后（其间注意保持湿度在80%～85%），洗净表面粘液，用70%酒精处理30 s，再用升汞处理15 min，用无菌水漂洗5次后备用。将已经灭菌的百合珠芽在解剖镜下，剥取不同大小（0.1～0.3、0.4～0.6、0.7～1.0 mm）的茎尖，接种在芽诱导培养基（MS+2.5 mg/L 6-BA+ 1.5 mg/L GA+ 0.5 mg/L NAA+0.1 g/L活性炭+0.6%琼脂+3%白糖）中，添加不同浓度的病毒唑（0、5、10 mg/L）。每处理接种40个茎尖，培养40～50 d后统计植株成活率。培养条件：先在黑暗条件下培养10 d，后转入光照强度600～800 lx，光照时间为10 h，温度25℃。

表1　3种病毒的引物

1.2.2百合3种主要病毒检测LSV和CMV 2种病毒采用王贤[18]和王丽花[19]所述的引物，LRV引物为通过NCBI Genebank中登记的病毒序列，利用引物设计软件Prime 6.0设计而成，引物核酸序列见表1。

待百合茎尖长至较大时，转至增殖培养基（MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.2 g/L活性炭+0.7%琼脂+30 g白糖）中继续培养30～40 d。待长出2～3片叶时切下叶片进行病毒检测，称取0.1 g百合组培苗叶片在液氮中研磨，用Trizol法提取总RNA，参照陈进[20]的RT-PCR法进行3种病毒检测，统计不同脱毒方法的脱毒率。

1.2.3数据分析试验数据采用SAS数据处理系统进行分析。

2　结果与分析

2.1热处理时间及剥取茎尖大小对不同病毒的脱毒效果

分别将3种病毒百合珠芽在不同热处理时间及不同茎尖大小的处理下接种在不添加病毒唑的芽诱导培养基中，培养40～50 d统计成活率后转至增殖培养基中，培养30～40 d，待长出2～3片叶时进行病毒检测并统计脱毒情况。由表2可知，对于CMV而言，茎尖的大小比热处理的脱毒效果更佳，当剥取的茎尖在0.1～0.3 mm大小时脱毒率可达100%，随着剥取茎尖的增大脱毒效果呈下降趋势。由表3可知，对于LSV而言，热处理脱毒效果优于茎尖大小，在一定范围内，随着热处理时间的延长，脱毒效果呈上升趋势，当热处理20 d时，剥取茎尖大小<0.7 mm时，脱毒效果最佳，达90%以上，但如果再延长热处理时间，脱毒效率反而下降。由表4可知，对于LRV而言，各处理脱毒效果均不佳，脱毒效果较好的处理为热处理20～30 d结合剥取0.1～0.3 mm茎尖，脱毒率为70%以上，仅用热处理结合剥取茎尖不能完全脱除该病毒。

综合表2～4可以看出，各处理间差异显著或极显著。茎尖大小同植株成活率成正比，同病毒脱毒率成反比；热处理时间在一定范围内对植株成活率影响不大，但当处理超过30 d会大大降低成活率。不同的热处理时间和剥取茎尖的大小对同一病毒的脱毒效果差异显著，不同病毒在相同的处理条件下脱毒效果差异也显著。

表2　热处理时间及剥取茎尖大小对CMV的脱毒效果

表3　热处理时间及剥取茎尖大小对LSV的脱毒效果

表4　热处理时间及剥取茎尖大小对LRV的脱毒效果

表5　热处理、茎尖大小及不同浓度病毒唑对不同病毒的脱除效果

2.2热处理、茎尖大小及不同浓度病毒唑对不同病毒的脱毒效果

分别将3种病毒百合珠芽分别在38℃下处理20 d后，剥取不同大小接种在添加不同浓度的病毒唑（0、5、10 mg/L）芽诱导培养基中，培养40～50 d统计成活率后转至增殖培养基中，培养30～40 d，待长出2～3片叶时进行病毒检测并统计脱毒情况。结果见表5。

从表5可知，各处理间存在显著或极显著差异。添加病毒唑对植株成活率影响不大，但对脱毒率影响非常显著，不同病毒种类对病毒唑的最佳浓度略有差异，在一定范围内病毒唑浓度的高低与病毒脱毒率成正比。特别对于LRV而言，不添加病毒唑时，脱毒率只能达到70%左右，添加病毒唑后，各处理差异极显著，试验中最佳的脱毒方法为：38℃下热处理20 d后，剥取0.4～0.6 mm茎尖，接种在添加10 mg/L病毒唑的芽诱导培养基中，脱毒率可达92.6%，提高脱毒率20%左右，效果非常明显。

3　结论与讨论

通过对CMV、LSV和LRV 3种病毒的脱毒方法的研究，筛选出适合各种病毒的最佳脱毒方法。3种病毒的脱除难易程度为：CMV

目前，百合的脱毒方法主要有热处理、茎尖培养、辐射处理和化学药剂处理等。由于茎尖顶端分生组织细胞分裂能力强，新陈代谢能力快，生长迅速，病毒含量极少或无[20]，因此茎尖培养是目前使用最广泛的脱毒方法。剥取的茎尖越小，脱除病毒效果越好，但同时存在成活率低下，易褐化死亡等问题，因此仅以此一种方法难以达到预期的效果[21]。高温热处理能使病毒钝化，抑制病毒的分化和转移，使其失去活性[22]，但单一使用这种方法不能有效脱除病毒，结合茎尖培养可大大提高脱毒效率。添加病毒唑也可起到钝化病毒、抑制病毒的自我复制和传播，达到降解病毒的作用，但也存在单独使用效果不明显的问题，需结合其他方法方可达到理想效果[23]。

试验采用茎尖培养结合热处理及添加病毒唑的方法对感染CMV、LSV及LRV 3种病毒的卷丹百合进行研究，3种脱毒方法对不同病毒的脱毒效果差异显著，3种方法相结合可以达到最好的脱毒效果，基本可以脱除3种病毒，这一结果与高慧卿[24]及王超[25]研究结果一致。试验只针对CMV、LSV及LRV 3种病毒进行研究，其他病毒是否也适用这种脱毒方法还有待进一步研究。

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（责任编辑：夏亚男）

Detoxification Methods of Three Viruses of Lilium lancifolium

ZHOU Xiao-bo1，2，WU Yi-fei1，2，DING Zhuo-yi1，2，CHEN Li-pei3，LI Shi-shu3，HUANG Li-ping3
（1. Hunan Vegetable Research Institute, Changsha 410125, PRC; 2. Hunan Vegetable Research and Development Center, Changsha 410125, PRC; 3. Hunan Xiangxi Autonomous Prefecture Economic Information Bureau of Longshan, Longshan 416000, PRC）

In order to obtain high quality seedlings without virus， the tiger Lilium lancifolium three main virus detoxification methods were studied. Taking CMV infection， LSV and LRV tiger Lilium lancifolium bulbil as experimental materials， the heat treatment， stem tip cultivation method of adding ribavirin combination， in the process of test using RT-PCR method to detect virus， discussed the optimum method of detoxification. Research results showed that: for CMV， only through cultivation stem tip， wring 0.1-0.3 mm size stem tip seedling cultivation rate can reach 100%， but the survival rate is only 45%; For LSV， heat treatment(38 ℃) in 20 days， wring 0.1-0.3 mm meristem-tip culture， detoxification effect was the best， reached more than 90%; For LRV， heat treatment(38 ℃) in 20 days， wring 0.4-0.6 mm meristem-tip culture， add 10 mg/L ribavirin the detoxication rate reached above 90%. Comprehensive seedling rate and survival rate of the three kinds of virus， with heat treatment(38 ℃) after 20 days， wring 0.4-0.6 mm meristem-tip culture， add 10 mg/L ribavirin， high survival rate， detoxification effect was the best.

Lilium lancifolium; virus; detoxification methods

S644.1

A

1006-060X（2016）10-0007-04

2016-08-08

湘西科技开发专项（2014FJ4184）

周晓波（1979-），男，湖南岳阳市人，助理研究员，主要从事蔬菜育种与生物技术研究。

吴艺飞