表皮生长因子受体基因突变与肺腺癌亚型关系的研究

李 歆,徐韫健，张承和美

(1.广州医科大学附属肿瘤医院检验科，广州 510095；2.广州医科大学附属第一医院检验科,广州 5101200；3.广州医科大学生物技术2011级，广州 528244)



·论 著·

表皮生长因子受体基因突变与肺腺癌亚型关系的研究

李 歆1,徐韫健2，张承和美3

(1.广州医科大学附属肿瘤医院检验科，广州 510095；2.广州医科大学附属第一医院检验科,广州 5101200；3.广州医科大学生物技术2011级，广州 528244)

目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因突变类型与肺腺癌亚型的相关性。方法 收集2011～2015年该院3 028例非小细胞肺腺癌(NSCLC)患者的肿瘤组织，提取DNA后采用突变阻滞扩增系统(ARMS)检测EGFR基因突变。结果 3 028例NSCLC患者标本中， EGFR基因突变率为39.7%，其中第19号外显子缺失突变543例，第21号外显子L858R点突变535例，共占89.8%；新分类中浸润前病变与微浸润性腺癌、浸润性腺癌的EGFR基因突变比较，差异有统计学意义(P<0.05)；中分化肺腺癌有较高的EGFR突变率,不同分化程度的EGFR突变率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 新分类表现出与分子诊断的相关性，不同亚型EGFR突变率有差异，EGFR基因突变与腺癌组织分化程度存在一定的相关性。

肺腺癌； 表皮生长因子受体； 基因突变； 亚型

肺癌已成为发病率和病死率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺腺癌(NSCLC)占原发性肺癌的80%[1]。近年来，肺腺癌发病率逐渐上升，已成为最常见的肺癌类型。分子靶向药物治疗是目前肿瘤治疗的最新策略之一，肺癌分子靶向治疗药物代表为表皮生长因子受体酪氨酸酶抑制剂(EGFR-TKI)。表皮生长因子受体(EGFR) 基因突变与 EGFR-TKI靶向药物的临床疗效密切相关。通过 EGFR 基因检测可筛选出最合适的患者进行有针对性的靶向治疗，从而显著提高药物疗效。有研究发现EGFR突变和肺腺癌的某些特殊亚型相关,如贴壁样为主型的腺癌具有更高的 EGFR突变率,对EGFR-TKI也更为敏感[2]。有研究报道，EGFR 突变与含乳头状和微乳头状亚型成分的腺癌呈正相关，与此相反，黏液性细支气管肺泡癌(BAC)的EGFR突变率却非常低[3-4]。现探讨不同肺腺癌亚型与EGFR基因突变的关系，为临床用药提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集肿瘤医院2011～2015年临床确诊的NSCLC患者3 028例，获取组织标本。根据国际多学科肺腺癌新分类标准[5-6]：Ⅰ型为浸润前病变：非典型腺瘤样增生、原位腺癌(包括非黏液型、黏液型、黏液/非黏液混合型)；Ⅱ型为微浸润性腺癌(包括非黏液型、黏液型、黏液/非黏液混合型)；Ⅲ型为浸润性腺癌：贴壁样生长为主型(原来的非黏液型BAC)、腺泡样为主型、乳头状为主型、微乳头状为主型、实性为主型伴黏液产生；Ⅳ型为浸润性腺癌变异型：浸润性黏液腺癌(原来的黏液型BAC)、胶样型腺癌、胎儿型腺癌(低分化和高分化)、肠型腺癌。

1.2 仪器与试剂 人类EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)和石蜡组织DNA提取试剂盒均购自厦门艾德生物医药科技有限公司；微量紫外分光光度计购自美国Thermo fisher scientific公司；CFX96荧光定量PCR仪购自美国BIO-RAD公司。

1.3 方法 (1)石蜡切片标本病理评估：抽取用于检测的连续切取石蜡切片1张，HE染色。高倍镜下选择切片上、下、左、右、中5个视野，每个视野连续计数30个细胞，合并5个视野结果，计算平均肿瘤细胞含量作为标本的肿瘤细胞含量。(2)DNA提取：严格按照艾德配套石蜡组织DNA提取试剂盒说明书进行操作。所提DNA经微量紫外分光光度计检测提取质量并确定含量，DNA的A260/A280在1.8～2.0之间，石蜡组织DNA 于-20 ℃ 保存。(3)加样：分别向45 mL待测标本DNA(约3.5 ng/μL)、阳性质控品和阴性对照加入2.25 μL Taq酶，混匀后依次取5 μL加入8联PCR管反应条的每孔中。(4)PCR反应参数：95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15个循环；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31个循环。在第3阶段60 ℃收集信号。

1.4 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较使用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EGFR基因突变类型与突变率结果比较 3 028例NSCLC患者标本中，EGFR基因突变率为39.7%。突变类型为第19号外显子缺失突变最多，占45.2%；其次为 第21号外显子L858R点突变，占44.6%。见表1。

表1 EGFR基因突变类型与突变率结果比较

2.2 新分类组织亚型与EGFR基因突变结果比较 1 201例EGFR基因突变NSCLC患者标本中，有217例病理分型不明确，不纳入统计。在新分类中，腺泡样为主型的浸润性腺癌例数最常见，占40.4%，其次是乳头状为主型的浸润性腺癌，占18.1%；腺泡样为主型的浸润性腺癌有较高的EGFR基因突变率(70.9%)，浸润前病变、微浸润性腺癌、浸润性腺癌和浸润变异型的EGFR基因突变比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 组织亚型与EGFR基因突变的结果比较[n(%)]

2.3 分化程度与EGFR基因突变的结果比较 603例有明确分化程度的标本中，低分化肺腺癌所占比例较多(54.9%)，高分化较少(2.3%)，而中分化肺腺癌则有较高的EGFR突变率(38.4%)，且不同分化程度的EGFR基因突变率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 分化程度与EGFR基因突变的结果比较[n(%)]

注：χ2=11.297 1；P=0.003 5。

3 讨 论

国外有学者发现肺腺癌亚型与 EGFR 突变状态密切相关，并认为 EGFR 突变在非黏液性BAC、乳头状和微乳头状腺癌亚型中发生率更高，而在其他组织学亚型中发生率较低，尤其在黏液性BAC亚型中EGFR突变率更低[2,4]。本研究结果表明，EGFR突变多见于微浸润性和浸润性(贴壁样、腺泡样、乳头状、微小乳头状为主型)肺腺癌，而EGFR突变率在非典型瘤样增生、浸润性黏液腺癌则相对较低；胶质样腺癌、胎儿型腺癌、肠腺癌标本量较少，因此突变率也较低。与有关报道基本一致[7]。混合有非黏液性 BAC成分和以乳头状成分为主的腺癌都可预测高 EGFR 突变率,而含黏液性 BAC成分的腺癌突变率较低。

有关组织学亚型与EGFR突变之间的密切联系，目前仍不清楚其真正原因。有研究报道，外周型肺腺癌主要起源于终末细支气管的Clara细胞和肺癌Ⅱ型上皮细胞，在该型腺癌中，甲状腺转录因子-1(TTF-1)的表达常为阳性；位于中央气道的腺癌主要起源于支气管基底细胞和黏液分泌细胞，TTF-1的表达为阴性[8]。有学者研究显示， TTF-1 在肺癌组织学分型等方面有着一定的作用，分别从其蛋白表达和 mRNA 水平进行研究，可作为鉴别组织学分型的标志物[9]。层序聚类分析也提示，2个差异的基因簇分别对应终末呼吸单位(TRU)和非终末呼吸单位(N-TRU)来源的腺癌。Yatabe[10]研究证实，TRU来源的腺癌是一种特别的腺癌类型，与细支气管肺泡癌特征非常符合，表现出独特的细胞学形态，以及TTF-1和细胞表面蛋白表达。有实验研究显示，在149例TRU 腺癌中，EGFR突变率为61.1%，97例EGFR突变患者中，高达91例(93.8%)为TRU腺癌。TRU腺癌预测EGFR突变具有高敏感性和特异性，对EGFR-TKI治疗更为有效。

关于肺癌组织分化程度与EGFR基因突变的关系，国内外文献少有报道。本研究对603例有明确分化程度的肺腺癌标本进行EGFR突变分析，发现中分化肺腺癌有较高的EGFR突变率，且不同分化程度的EGFR基因突变率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与黄光辉等[11]的研究相似。高、中、低分化基因突变率分别为35.1%、50.6%、23.7%,说明EGFR基因突变与NSCLC腺癌组织分化程度存在一定的相关性。

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Association of EGFR mutation with histologic subtypes in lung adenocarcinoma

LIXin1,XUYunjian2,ZHANGChenghemei3

(1.DepartmentofMedicalLaboratory,HospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510095，China；2.DepartmentofMedicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou,Guangdong510120,China；3.DepartmentofBiotechnology2011Grade,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong528244,China)

Objective To assess the association of epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation with histologic subtypes in lung adenocarcinoma.Methods Lung cancer tissues were collected from 3 028 cases of patients with non-small cell lung cancer,DNA was extracted respectively,and EGFR gene exons 18,19,20 and 2l mutations were dectected by ARMS-PCR amplification.The association of EGFR mutation with histologic subtypes in lung adenocarcinoma was analyzed.Results The mutation rate of EGFR detection was 39.7%，most were exon 19 del and exon 21 L858R (proportion 89.8%);according to the new classification,EGFR gene mutation in infiltrating lesions with micro infiltrating adenocarcinoma and infiltrating adenocarcinoma were different(P<0.05).EGFR mutation rates were higher in moderately differentiated lung adenocarcinoma,degree of differentiation of EGFR mutation rates were statistically different(P<0.05).Conclusion The new classification showes a correlation with molecular diagnosis,different subtypes of EGFR mutation rate is different.There is a certain correlation between EGFR gene mutation and the degree of differentiation in adenocarcinoma.

lung adenocarcinoma； epidermal growth factor receptor； gene mutation； histologic subtype

李歆,女,主管技师，主要从事临床检验技术研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.007

A

1673-4130(2016)20-2820-03

2016-04-11

2016-06-26)