《临床检验基础》课程中细胞计数的常用方法*

2016-11-19严家来陈雨京张发苏

包头医学院学报 2016年6期

关键词：稀释液方格血细胞

严家来，陈雨京，张发苏

(安徽医学高等专科学校医学技术系，安徽合肥 230601)

《临床检验基础》课程中细胞计数的常用方法*

严家来，陈雨京，张发苏

(安徽医学高等专科学校医学技术系，安徽合肥 230601)

《临床检验基础》课程中2项核心技能是细胞计数与形态辨认，涉及血液一般检验和体液检验两大模块。虽然当前许多项目在一定程度上实现了仪器自动化计数[1]，但手工计数仍必不可少，是从业者的一项重要职业技能，中外制定了相关操作手册[2]，甚至细化为标准化操作程序[3](Standard Operation Procedure，SOP)。本文对该课程中有关细胞计数的方法整理如下。

1 血细胞计数

1.1 血细胞计数原理用血细胞稀释液将血液标本稀释一定倍数，混匀冲入改良牛鲍氏计数板(Neubauer improved chamber)的计数池内，利用计数池的划线分隔，计数特定范围内的血细胞数，最后换算成一定体积(通常为1 L)的血细胞数。原理所涉及的问题有：(1)关于稀释倍数：稀释倍数要根据细胞数量，由稀释液和样品量决定；(2)关于计数范围：计数的细胞不能太多，否则增大工作量，降低工作效率；计数的细胞又不能太少，否则存在抽样误差；(3)关于结果的计算：根据稀释倍数、计数范围和使用的体积单位计算。先计算1个大方格内(即0.1μL)的细胞数，再乘以稀释倍数和体积换算系数。

1.2 计数板的结构血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4个凹槽构成3个平台。中间的平台较宽，被两横一纵的“H”形凹槽分为上、下两个相同的计数池(室)。计数池两侧各有一条支柱，比计数池平面高出0.1 mm，计数池(室)上面各刻有一方格网，方格网共分9个大方格(图1)。大方格用粗线隔开，边长是1 mm，面积为1 mm2，盖上盖玻片后，中间空隙高度为0.1 mm，所以每个大方格的体积为0.1 mm3。大方格有2种刻度，一种是四角的4个大方格，每个大方格分为16个中方格，每个中方格的面积是1/16 mm2；另一种是中间的一个大方格，每个大方格分为25个中方格，中方格之间用双线分开，每个中方格又分成16个小方格。每个中方格的面积为1/25 mm2、体积为1/250 mm3，每个小方格的面积为1/400 mm2、体积为1/4000 mm3。

1.3 血细胞计数方法以白细胞计数为例，白细胞稀释液0.38 mL加入20 μL全血，充分混匀，充池后沉淀2～3 min，在低倍镜下(10×)计数四角的4个大方格内的细胞数(图2)。可按下面的公式计算细胞密度。

N：表示4个大方格内数得的白细胞总数；

/4：除以4，得到每个大方格的白细胞平均数量；

×10：将1个大方格的白细胞数换算成1 μL血液内白细胞数；

×20：血液的稀释倍数；

×106：由1 μL换算成1 L。

其他血细胞计数与白细胞计数相比，既有不同，也有相似之处[4]，见表1。

表1 几种血细胞计数的比较

2 体液细胞计数

2.1 精子计数 0.38 mL 5 %碳酸氢钠溶液中加入20 μL完全液化后混匀的精液，再次混匀充池后静置片刻，在高倍镜下计数中央5个中方格内精子数。最终细胞密度=(N/5)×25×10×20×106/L=N×109/L。

2.2 尿液、脑脊液、胸水、腹水中的细胞计数如标本外观无明显颜色改变，一般细胞较少，不需稀释，可直接计数。脑脊液中细胞数的计数：可计数4个大方格的细胞数，最终细胞密度=(N/4)×10×106/L=2.5×N×106/L。尿液中细胞数的计数：可计数10个大方格中的细胞数，最终细胞密度=N/μL。如果细胞较多，可用等渗液(如生理盐水)稀释一定倍数后再计数，计算细胞数时乘以稀释倍数。

3 注意事项

3.1 标本的采集许多因素如剧烈运动、情绪激动、严寒、暴热、用药等，可影响体内细胞的循环和分布，且不同时间点有差异，要消除这些影响。标本要顺利采集、及时检验，以免结果不准确，如体液中的细胞可因细菌感染而很快自溶或由于渗透压的原因变形甚至被破坏。

3.2 计数误差细胞显微镜计数的误差主要有技术误差(technical errors)和固有误差(inherent errors)两大类。

3.2.1 技术误差由于操作不正规或使用器材不准确造成的误差称为技术误差。通过熟练的操作及仪器的校正减小甚至避免这类误差。导致技术误差的常见原因有：(1)器材误差：如稀释用吸管、微量采血管或计数板超过各自允许误差，未经校正，盖玻片不平整等；稀释液未过滤，杂质太多影响计数等；(2)稀释倍数不准：如吸取稀释液或血液的量不准确、稀释液放置过久水分蒸发等；(3)混匀不当：导致细胞分布不均；(4)充池不当：充池前细胞悬液未充分混匀、充池过多或过少、充液不连续、计数室内有气泡、充液后移动盖玻片、操作台不平等均可使细胞分布不均，造成计数结果误差；(5)细胞计数不准确：大方格外线压线细胞计数时，未遵守“数上不数下，数左不数右”的原则图3；不能准确辨认细胞等；(6)重复计数和漏数：应按照一定的顺序计数细胞，如“弓”字形或“城垛样”；(7)细胞聚集：血液抗凝不佳，细胞发生聚集和体液中白细胞聚集成脓球，不易区分；(8)细胞破坏：对血小板和嗜酸性粒细胞的计数时间超过1 h，将导致计数结果降低。

注：左图实心圆表示计数的细胞，空心圆表示不计数的细胞，右图表示细胞计数的结果

3.2.2 固有误差又称计数域误差，是由于计数室内每次血细胞分布不可能完全相同所造成的误差，其变异系数与计数细胞的多少成反比。扩大计数范围，计数细胞越多，误差越小。嗜酸性粒细胞计数就采用了10个大方格计数，红细胞和血小板只计数中央大方格内5个中方格。

3.3 细胞的相互影响

3.2.1 有核红细胞对白细胞计数的影响正常情况下，血液中不会出现有核红细胞。某些疾病如溶血性贫血，外周血中可出现大量有核红细胞，其不能被白细胞稀释液破坏，计数时与白细胞一同被计数使白细胞计数结果偏高。因此，当血液中出现较多有核红细胞时，必须将其扣除。校正公式如下：

x：校正前白细胞数

y：在白细胞分类计数时，计数100个白细胞的同时计数到的有核红细胞数。

例如：校正前白细胞数为12×109/L，在作白细胞分类计数时计数100个白细胞的同时数得的有核红细胞数为25个，则

3.3.2 白细胞对红细胞计数的影响红细胞数比白细胞数多得多，一般影响较小。当白细胞数>100×109/L时，就应该考虑将其扣除。如当红细胞3.3×1012/L、白细胞120×109/L时，病人实际红细胞数=计得红细胞数-白细胞数=3.18×1012/L。

[1] 邓素君，吴敏瑾，周学，等.AVE-763尿液有形成分分析仪在浆膜腔积液细胞计数中的临床应用[J].浙江临床医学，2012，14(1)：688-689.

[2] 叶应妩，王毓三，申子瑜.临床检验操作规程[M].3版.南京：东南大学出版社，2006：4-5.

[3] 徐淑贞，陈明涛.检验科SOP文件编写的体会[J].中医药管理杂志，2011，19(7)：688-689.

[4] 曹元应，严家来.医学检验综合实训[M].南京：东南大学出版社，2014：10.