农村犬狂犬病不同免疫程序的免疫效果比较研究

蒋碧美，吴焕婷，梁海燕，夏汉武，赖俊新，姚彩兰，宋伟科，陈　明，江金初，罗满玉

（广州市增城区动物卫生监督所，广东广州　511300）

农村犬狂犬病不同免疫程序的免疫效果比较研究

蒋碧美，吴焕婷，梁海燕，夏汉武，赖俊新，姚彩兰，宋伟科，陈明，江金初，罗满玉

（广州市增城区动物卫生监督所，广东广州511300）

［目的］评估广州市增城地区农村犬狂犬病抗体水平现状，比较不同免疫程序对该地区农村犬狂犬病免疫效果的影响。［方法］采用问卷调查与抽样检测相结合的方法，抽取该地区一定数量的农村犬，随机分成4组：春秋两季2次免疫组（A组）、仅春季免疫组（B组）、仅秋季免疫组（C组）和春秋两季均不免疫组（D组）。对不同组别的试验犬只实施不同的免疫程序，并进行试验前后两次血清采样和抗体ELISA检测。［结果］试验前的采样检测结果显示：最后一次免疫在2014年10月和11月的试验犬只，抗体合格率分别是35.7%、36.4%；不同性别、不同年龄的试验犬只抗体合格率均无统计学差异。试验后的采样检测结果显示：A组、B组、C组和D组的抗体合格率分别为100.0%、66.7%、94.6%和34.8%，春防免疫与秋防免疫主效应明显，交互效应不明显。试验犬只抗体滴度（Titer）均值和抗体合格率统计分析显示：A组与B组、A组与D组、B组与C组均差异显著；B组与D组Titer均值差异不显著，抗体合格率差异显著。［结论］综合认为，犬的性别和年龄对免疫效果影响较小；全年免疫一次的抗体合格率达不到世界卫生组织（WHO）推荐的及国家要求的全年维持在70%以上的标准；实行全年两次免疫，能有效提升犬只狂犬病的抗体保护水平。

狂犬病；免疫程序；免疫效果调查；析因设计

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种高度致死性人兽共患 传染病［1］，主要表现为神经系统症状，病死率几乎为100%。我国狂犬病主要流行于农村，占总病例数的50%～70%［2］。疫苗接种是预防狂犬病最主要的方法［3］。世界卫生组织（WHO）提出，当动物群体的狂犬病有效免疫率超过70%时，即可控制动物狂犬病的发生和流行［4-5］。在广州市增城区，农村犬占绝大多数。近年来该地区严格按照国家相关规定，实行每年春季和秋季两次集中免疫。但目前全年春秋两季集中免疫的效果如何，不是十分清楚。此外，能否在有效防控狂犬病的前提下，将全年两次免疫调整为全年集中免疫一次，以便节约人力和物力，也有待研究证实。为此开展本次研究，比较分析不同免疫程序的免疫效果，以期为该地区有效防治狂犬病和调整免疫政策提供技术支持。

1　材料与方法

1.1 疫苗

广州市动物疫病预防控制中心招标采购的“瑞贝康”狂犬病灭活疫苗（G52株）（原产地法国梅里亚），批号：L415085。

1.2 调查对象和抽样分组方案

采用三阶段随机抽样方法，对广州市增城区的农村犬进行调查。首先在该区11个镇街中随机抽取4个，然后从每个被抽中的镇街中随机抽取2个村，每个村随机抽20只犬，共160只。用Microsoft Excel的RANDBETWEEN（1，160）函数生成160个随机整数，每只试验犬只对应1个随机整数，用其对应的这个随机整数除以4，余数分别为0、1、2、3。余数相同的归为一组，分别定义为A组、B组、C组、D组。最终得到的4组犬只数量分别为A组48只、B组38只、C组41只、D组33只。

1.3 调查时间和方法

采用问卷调查和抽样检测相结合的方法。2015年4月，通过查看试验犬只免疫记录和对犬主人进行问卷调查，获得试验犬只年龄、性别、最后一次免疫狂犬病疫苗时间等相关信息。对试验犬只进行唯一性编号和分组标识，佩戴相应的标识牌，并进行第一次（试验前）血清采样。在不改变试验犬只饲养习惯和环境条件的前提下，对4组试验犬只分别作不同的免疫程序干预（表1）。秋防免疫后1个月（2015年11月）进行第二次（试验后）血清采样。各组试验犬只两次采样数及失访数见表2。通过访问犬主人得知，失访原因均为丢失。故本研究是基于未失访的132只犬进行的血清检测结果比较分析。

表1　不同组别试验犬只的免疫程序

表2　各组试验犬只采样数量及失访情况统计

1.4 样品保存

按常规方法，采集犬血液并进行血清分离，然后置于-20 ℃保存待用，使用前血清经56 ℃热灭活30 min。

1.5 检测试剂和方法

法国辛百克斯狂犬病抗体ELISA试剂盒，购自广州悦翔生物科技有限公司（批号：14 SRAB3 23）；世界卫生组织（WHO）狂犬病标准血清，购自狂犬病WHO参考实验室。检测过程严格按照试剂盒说明书规定操作，并进行定量和定性判定。定量判定方法：用法国辛百克斯公司提供的Excel格式软件计算待检样品抗体滴度，用Titer值表示。定性判定方法：按照世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》和抗体检测试剂盒的说明判定，免疫狂犬病疫苗的犬，其抗体滴度≥0.6 EU/mL：判定为免疫抗体合格；抗体滴度＜0.6 EU/mL，判定为免疫抗体不合格。

1.6 数据分析与统计

所有数据用Microsoft Excel和SPSS 18.0进行分析和统计。

2　结果

2.1 试验犬只第一次采样的抗体滴度和抗体合格率比较

2.1.1 组间抗体水平比较。4组狂犬病抗体滴度均值分别是0.965、0.973、1.002、1.379，单因素方差分析无统计学差异（p=0.794＞0.05）。4组狂犬病抗体合格率分别为38.1%、26.7%、35.1%、30.4%，卡方检验无统计学差异（Pearsonχ2=1.170，p=0.760＞0.05）。详见表3。

表3　各组第一次采样检测的狂犬病抗体水平

2.1.2 性别间抗体水平比较。公犬平均抗体合格率为37.5%，母犬抗体合格率为30.3%，卡方检验差异不显著（Pearsonχ2=0.760，p=0.383＞0.05）。各组性别组成见表4。

表4　不同处理组试验犬只性别分布

2.1.3 年龄间抗体水平比较。试验犬只中，年龄最大的10岁，最小的0.25岁，中位数为2.00。Kolmogorov-Smirnova正 态 性 检 验p=0.000＜ 0.01，不服从正态分布（图1）。以中位数为基准，把试验犬只分成两组：一组年龄≤2.00，另一组年龄＞2.00。第一次采样检测结果显示：两组抗体合格率分别是29.1%、41.3%，卡方检验无统计学差异（Pearsonχ2=2.019，p=0.155＞0.05）。

图1　试验犬只年龄分布

2.1.4 最后一次不同免疫日期间的抗体水平比较。84只（2014年10月）、33只（2014年11月）、1只（2015年3月）、1只（2015年5月），其余13只最后一次免疫时间不详。第一次采样检测结果显示前两者抗体合格率分别是35.7%（30/84）、36.4%（12/33）。

2.2 试验犬只第二次采样的抗体滴度和抗体合格率比较

4组狂犬病抗体滴度均值分别是29.103、6.458、20.895、3.370（表5）。单因素方差分析结果认为4组均值不全相等（p=0.000＜0.01）。进一步两两比较的结果见表6。

表5　各组第二次采样的狂犬病抗体水平

表6　各组第二次采样的狂犬病抗体滴度（Titer）均值Tamhane两两比较

4组狂犬病抗体合格率分别为100.0%、66.7%、94.6%、34.8%（表5）。卡方检验认为4组试验犬只抗体合格率不全相等（似然比χ2=50.281，p=0.000＜0.01）。进一步两两比较的结果见表7。

表7　各组第二次采样的狂犬病抗体合格率两两比较

2.3 春防、秋防后各组试验犬只抗体滴度增长值析因分析

在析因设计实验研究中，主效应是不考虑其他研究变量的变化或将其他研究变量的变化效应平均掉，单独考察一个自变量对因变量的变化效应。交互效应则是反映两个或两个以上自变量相互依赖、相互制约，共同对因变量的变化发生影响［6］。

用第二次采样的抗体Titer值减去第一次采样的抗体Titer值评价春防、秋防后试验犬只抗体滴度增长情况。4组试验犬只两次免疫后抗体Titer增长均值见图2。

图2　不同组别两次免疫后Titer增长均值

对其结果进行析因分析发现：春防免疫主效应明显（F=7.175，p=0.008＜0.01）；秋防免疫主效应明显（F=85.626，p=0.000＜0.01）；春防免疫和秋防免疫交互效应无统计学意义（F=1.176，P=0.280＞0.05）。

3 讨论

本研究第一次采样检测的结果显示，4组试验犬只抗体滴度均值和抗体合格率均无统计学差异，说明在随机分组下，各组狂犬病基础抗体水平没有明显差异。第二次采样检测结果显示，免疫的A组、B组、C组试验犬只抗体合格率均与未免疫的D组有统计学差异，并且春防免疫与秋防免疫主效应均明显。说明注射狂犬病灭活疫苗对试验犬只产生抗体有积极作用，能有效提高免疫抗体保护水平。这与覃勇等［7］的研究结论一致，同时也间接证明了该地区采购的疫苗质量可靠，免疫实施有效。

国内学者李坚等［8］对上海市青浦区散养犬免疫后不同时间的免疫抗体合格率进行比较研究，认为在免疫180 d后仍然有75%（6/8）的犬只免疫抗体合格。而在本调查研究中，2015年4月第一次采样检测结果显示，最后一次免疫时间在2014年10月和11月的试验犬只，抗体合格率分别是35.7%、36.4%，已经不能维持在70%以上。造成结论差异的原因可能有以下几方面：一是研究方法不同，前者的研究为干预实验，而本研究为横断面调查；二是两者所用疫苗类型、生产商以及疫苗质量可能不一样；三是选用的检测方法和判定标准不一样。

按α= 0.05水准，本研究第二次采样检测结果显示：春防、秋防都免疫的A组抗体保护水平比春防单次免疫的B组要好，比未免疫的D组也要好；免疫6个月后的B组抗体滴度和未免疫的D组相当，免疫6个月后的B组抗体合格率为66.7%，低于70%。

按α= 0.05水准，本研究析因分析显示：春防免疫组犬只抗体滴度增长均值（16.811）大于未免疫组犬只（10.942）；秋防免疫组犬只抗体滴度增长均值（24.015）大于未免疫组犬只（3.738）；春防免疫与秋防免疫不存在交互效应。可见春、秋两季免疫效果独自作用明显，相互作用并不显著。

基于以上分析，本研究认为，在不改变目前狂犬病免疫程序和所用疫苗的前提下，全年实行单次免疫，抗体水平维持时间较短，其合格率达不到WHO推荐及国家要求的70%以上的标准，存在自然感染和传染的风险。全年实行两次免疫，特别是在前一次免疫抗体下降到较低水平时，再补免一针，能有效提升犬只狂犬病抗体保护水平。

本研究还对犬只的年龄、性别对抗体合格率的影响进行分析，结论是年龄、性别因素对犬只抗体影响不大，这与谭海等［9］对广州市犬狂犬病抗体横断面调查的结论一致。另外，由于受客观条件所限，本研究未能完全消除失访、错误免疫试验犬只，以及最后一次免疫时间不一致等因素带来的偏倚。

致谢：感谢参与此次实验研究的工作人员，包括广州市增城区动物卫生监督所荔城分 所、石滩分所、中新分所、派潭分所的工作人员及犬主人；感谢广州市动物卫生监督所的张海明和钟锦辉在实验设计、数据分析及文章写作方面给予的指导和帮助。

［1］ Dodet B. An important date in rabies history［J］.Vac-cine， 2007，25（52）：8647-8650.

［2］ 盛圆贤，赵德明. 狂犬病流行态势及其防控策略的研究进展［J］. 中国兽医科学，2009，39（9）：835-838.

［3］ Shim E，Hampson K，Cleaveland S，et al. Evaluating the cost-effectiveness of rabies post-exposure prophylaxis：a case study in Tanzania［J］.Vaccine，2009，27（51）：7167-7172.

［4］ 郑学星，杨松涛，王化磊，等. 狂犬病病毒HEP-FlurymEG株的诊断与鉴定［J］. 中国病原生物学杂志，2012，7（12）：881-884.

［5］ WHO. Expert consultation on rabies（First report）［J］. Genva，2004，13：48-58.

［6］ 方积乾. 卫生统计学［M］. 5版. 北京：人民卫生出版社，2003：136.

［7］ 覃勇，蒙振亩，胡杰，等. 百色市农村散养犬狂犬病免疫抗体消长情况调查报告［J］. 大众科技，2012，14（155）：207-224.

［8］ 李坚，袁明龙. 犬狂犬病免疫的调查与探讨［J］. 上海畜牧兽医通讯，2006（5）：38-39.

［9］ 谭海，段晓冬，张海明，等. 2014年广州市区犬狂犬病横断面调查［J］. 中国动物检疫，2015，32（2）：14-18.

（责任编辑：朱迪国）

Comparative Study on Immune Effects of Rabies Vaccination towards Rural Canines by Different Immunization Procedures

Jiang Bimei，Wu Huanting，Liang Haiyan，Xia Hanwu，Lai Junxin，Yao Cailan，Song Weike，Chen Ming，Jiang Jinchu，Luo Manyu
（Zengcheng Animal Health Inspection Institution， Guangzhou，Guangdong 511300）

［Objective］To evaluate the current situation of rabies antibody level of rural canines in Zengcheng district and to compare the immune effects under different vaccination procedures. ［Methods］By the methods of questionnaire survey and sampling detection，a certain number of rural canines were randomly sampled and allocated into four groups（group A，B，C and D）. Then different vaccination procedures were conducted for these experimental dogs of the above four groups，and serum samples were collected and detected by ELISA for twice. ［Results］In the fi rst detection before experimentation，the qualification rates of rabies antibodies were 35.7% and 36.4% respectively，when the experimental dogs were vaccinated in October and November 2014 for the last time. Gender and age were of no signifi cant statistical difference. Results of the second detection （after experimentation）showed that the qualifi cation rates of rabies antibodies of group A（immunized for twice in spring and autumn），group B（only immunized in spring），group C（only immunized in autumn）and group D（no immunization）were 100.0%，66.7%，94.6% and 34.8%，respectively. The data demonstrated that the main effect of immunization in spring and autumn were obvious，but not for the interaction effect. The statistical analysis on the mean antibody titers and qualifi ed rates showed that the differences between group A and B，group A and D，group B and C were signifi cant，the qualifi ed rates ofrabies antibodies between group B and D were obvious，but not for the mean antibody titers.［Conclusion］In overall consideration，the immune effects were less affected by gender and age. Once vaccination per year was not enough to maintain the antibody level of the standard（ratio of 70% in the whole year）according to the recommendation of WHO and request of China. And the immunological protection for rural canines would be enhanced effectively under twice immunization per year.

Rabies；vaccination procedures；immune effect investigation；factorial design

S851.33

B

1005-944X（2016）11-0001-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.001

罗满玉