酸橙酚类物质的提取工艺?优化及分布和抗氧化活性研究

蒋展沫，孙 杰，易 阳，闵 婷，王丽梅

（武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉 430023）

酸橙酚类物质的提取工艺?优化及分布和抗氧化活性研究

蒋展沫，孙 杰，*易 阳，闵 婷，王丽梅

（武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉 430023）

研究酸橙果实不同部位酚类物质在含量及抗氧化贡献上的差异。在单因素试验的基础上，建立以多酚提取率为响应值的四因素回归模型，优化酸橙果肉酚类物质的提取工艺。提取测定酸橙不同部位酚类物质含量，采用HPLC-MS法分析其酚类物质组成，并评价其DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和FRAP总抗氧化能力。酸橙果肉多酚提取最佳工艺参数为料液比1∶16（g∶mL），乙醇体积分数46%，pH值2.5，浸提温度39℃，此条件下的多酚提取率达0.45%。酸橙中酚类物质主要以游离态存在，其中游离酚含量从大到小依次为橙肉＞橙皮＞橙籽，而游离黄酮含量从大到小依次为橙皮＞橙籽＞橙肉；酸橙的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和FRAP总抗氧化能力从大到小依次为橙肉＞橙皮＞橙籽。

酸橙；酚类物质；提取；分布；抗氧化

酸橙（Citrus aurantium L.） 是芸香科柑橘属植物，属于药食同源水果，其幼果可用于干制加工中药材枳实和枳壳，用于宽中下气、消导积滞和祛痰燥湿等。酸橙幼果的活性成分及其生理功效在食品和医药领域已引起广泛关注，尤其是酚类化合物的抗氧化、抗肿瘤、促进胃肠蠕动等功能活性［1］。然而，酸橙成熟果实的相关研究报道鲜见。酸橙果实成熟后，其氨基酸、糖类和维生素等营养成分含量均显著增加，但仍存在较重的酸味和涩味，不宜直接食用和加工食品，仅少部分用于加工饲料、果汁和果酱等［2-3］。以酚类化合物为代表的天然活性成分提取开发是酸橙精深加工的重要途径。

酚类物质具有较强的抗氧化活性，富含该类活性物质的植物资源发掘和筛选一直备受关注［4］。植物不同组织部位中酚类物质在含量、组成和抗氧化活性等方面往往有所差异，其开发利用亦应有所侧重。酸橙果皮、果汁和种子中酚类化合物的含量及抗氧化活性虽各有报道，但不同部位之间的差异并不清楚。本研究采用响应面法优化酸橙果肉中酚类化合物的提取工艺，进一步提取分析酸橙不同部位中游离态和结合态酚类物质的含量及抗氧化活性，以期为酸橙天然抗氧化活性成分的提取开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

成熟的黄皮酸橙，湖北省荆州市卷桥柑橘专业合作社提供，试验前分取果肉、果皮和种子，分别粉碎、匀浆后使用。

XFH-D型高速分散器、SB-5200DNT型超声波清洗仪，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；HR7633型飞利浦榨汁机，飞利浦家庭电器有限公司产品；TGLL-16A型台式高速冷冻离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司产品；PHS-25型pH计，上海虹益仪器仪表有限公司产品；UV-1800型紫外可见分光光度计，日本岛津有限公司产品；电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司产品。

没食子酸（Gallic acid）、水溶性VE（Trolox）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、芦丁（Rutin），东京化成工业株式会社产品；FeCl3，Na2CO3，AlCl3·6H2O，NaNO2和福林酚试剂等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品。

1.2 酸橙果肉多酚提取工艺优化

1.2.1 工艺流程

称取3.00±0.05 g果肉匀浆后置于一定体积的乙醇溶液中，以转速10 000 r/min高速均质处理2 min后，采用0.1 mol/L NaOH溶液或0.1 mol/L HCl溶液调节至适当pH值。料液置于控温的120 W超声场中持续浸提一定时间后，离心（4 000 r/min，10 min）、过滤分离滤液，定容至100 mL，混匀后待测。

1.2.2 单因素试验

（1）料液比。在乙醇体积分数40%，pH值4，浸提温度50℃，浸提时间20 min的条件下，考察不同料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25）对多酚提取率的影响。

（2）乙醇体积分数。在料液比1∶15，pH值4，浸提温度50℃，浸提时间20 min的条件下，考察乙醇溶液不同体积分数（0，20%，40%，60%，80%）对多酚提取率的影响。

（3）pH值。在料液比1∶15，乙醇体积分数40%，浸提温度50℃，浸提时间20 min的条件下，考察不同pH值（2，3，4，5，6）对多酚提取率的影响。

（4）浸提温度。在料液比1∶15，乙醇体积分数40%，pH值4，浸提时间20 min的条件下，考察不同提取温度（20，30，40，50，60℃）对多酚提取率的影响。

（5）浸提时间。在料液比1∶15，乙醇体积分数40%，pH值4，浸提温度50℃的条件下，考察不同浸提时间（5，10，20，40，60 min）对多酚提取率的影响。

1.2.3 响应面试验

响应面试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面试验因素及水平设计

在单因素试验的基础上，采用Box-Benhnken中心组合设计四因素三水平试验。

1.3 酸橙游离态和结合态酚类物质的提取

游离态酚类物质的提取采用响应面法优化的酸橙多酚提取工艺。称取3.00±0.05 g样品置于48 mL的46%乙醇溶液中，以转速10 000 r/min高速均质处理2 min后调节pH值至2.5。料液于39℃下超声浸提10 min后，经离心、过滤分离滤液。滤渣加入48 mL的46%乙醇溶液并重复以上步骤提取2次，合并滤液。将滤液于45℃下旋转蒸发浓缩，并用46%乙醇溶液定容至25 mL，置于-20℃保存待测。结合态酚类物质方法提取，定容至10 mL后置于-20℃保存待测。提取制备重复平行3次。

1.4 分析方法

1.4.1 总酚和总黄酮测定

总酚和总黄酮的测定方法参考文献［4］；多酚提取率（%）以湿基（WW）中所含没食子当量（GAE）的质量百分比计；酸橙不同部位总酚含量以每100 g湿基中所含没食子酸当量表示（mg GAE/100 g WW），总黄酮含量以每100 g湿基中所含芦丁当量（RE）表示（mg RE/100 g WW）。

1.4.2 抗氧化活性评价

DPPH自由基清除能力参考文献［5］方法测定不同浓度（30，60，90 μg GAE/mL）样液的DPPH自由基清除率；ABTS自由基清除能力采用文献［4］方法测定不同浓度样液的ABTS自由基清除效果；FRAP抗氧化能力采用文献［4］方法测定不同浓度样液的FRAP抗氧化作用。

1.5 统计分析

Box-Benhnken中心组合设计和响应面分析采用SAS（V8）软件处理；采用IBM SPSS19统计软件进行单因素方差分析，组间0.05水平的统计学差异采用S-N-K检验（Student-Newman-Keuls test）。数据均以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 各试验因素对酸橙果肉多酚提取率的影响

各试验因素对酸橙果肉多酚提取率的影响见图1。

图1 各试验因素对酸橙果肉多酚提取率的影响

由图1（a）可知，多酚提取率随料液比的减小而逐渐增大。料液比1∶15时的多酚提取率显著高于1∶5和1∶10（p＜0.05），但随着料液比的进一步减小，多酚提取率并未显著增加（p＞0.05）。由此，选择酸橙多酚浸提的适宜料液比为1∶10～1∶20。

由图1（b）可知，多酚提取率随乙醇体积分数的增加呈先增大后减小的趋势。酸橙果肉中酚类物质可能具有相对较宽的极性分布，且大部分与20%～60%乙醇溶液的极性相当，故在此体积分数范围内表现出较高的多酚提取率，各体积分数之间并无显著性差异（p＞0.05），但均显著高于纯水和80%乙醇的提取率（p＜0.05）。由此，选择酸橙果肉多酚浸提的适宜乙醇体积分数范围为20%～60%。

由图1（c）可知，随着浸提液pH值的增加，酸橙果肉多酚提取率发生明显下降。pH值为2时的多酚提取率最高（p＜0.05），而pH值介于3～5时多酚提取率无显著差异（p＞0.05）。偏酸条件可能有利于组织中部分与多糖和蛋白以氢键和（或）疏水键结合的酚类物质解离，故适宜的酸橙果肉多酚浸提pH值范围为2～4。

由图1（d）可知，酸橙多酚提取率随浸提温度的增加呈先增大后减小的趋势。浸提温度40℃时的多酚提取率显著高于20℃和60℃（p＜0.05），但与30℃和50℃的提取率无显著差异（p＞0.05）。浸提温度增加有利于酚类物质溶出，但高温可能导致酚类物质的分解，故适宜的酸橙果肉多酚浸提温度范围为30～50℃。

由图1（e）可知，在浸提时间5～60 min内的多酚提取率并无显著变化（p＞0.05），故选定酸橙果肉多酚浸提时间为5min。

2.2 酸橙果肉多酚提取响应面试验结果

响应面试验设计及结果见表2，回归模型方差分析见表3。

表2 响应面试验设计及结果

表3 回归模型方差分析

以料液比X1，乙醇体积分数X2，pH值X3，浸提温度X4为试验因素，建立以酸橙果肉多酚提取率Y为考察指标的回归模型如下：

Y=0.437 9+0.003 6X1+0.006 3X2-0.007 4X3-

0.009 8X4-0.017 4X12+0.003 0X1X2-

0.007 7X1X3-0.000 1X1X4-0.016 2X22-0.005 4X2X3-0.002 4X2X4-0.010 6X32-0.004 9X3X4-0.033 7X42.

由表3可知，回归达到极显著水平（p＜0.000 1），考察指标Y的决定系数R2值达94.68%，模型拟合较好。逐项显著性检验发现：线性项和平方项对Y值有极显著影响（p＜0.001），而交互项对Y值影响不显著（p＞0.05）；线性项中，X2，X3和X4均对Y值有极显著影响（p＜0.01），而影响程度依次减弱；交互项中仅X1X3显著影响Y值（p＜0.05）。

采用RSREG Procedure分析回归模型得到极值点，各因素的编码值分别为X1=0.235 6，X2=0.306 9，X3=-0.484 2，X4=-0.121 2，响应值Y=0.441 7%。将各因素编码转化并取整得到酸橙果肉多酚提取的最佳工艺参数为料液比1∶16，乙醇体积分数46%，pH值2.5及浸提温度39℃，在此条件下的提取率预测值为0.44%，而实际提取率为0.45%。

2.3 酸橙不同部位酚类物质含量及组成

酸橙不同部位酚类物质含量见图2。

由图2可知，酸橙不同部位的多酚和黄酮均以游离态为主，其中橙肉游离酚含量（519.73 mg GAE/100 g WW）显著高于橙皮（p＜0.05），而橙籽中游离酚含量最低（120.28 mg GAE/100 g WW）；橙皮具有最高的游离黄酮含量（670.65 mg RE/100 g WW），而橙籽中游离黄酮含量显著高于橙肉（p＜0.05）。

图2 酸橙不同部位酚类物质含量

2.4 酸橙不同部位的抗氧化能力比较

酸橙果实不同部位的抗氧化能力比较见表4。

表4 酸橙果实不同部位的抗氧化能力比较

由表4可知，酸橙不同部位的抗氧化能力以100 g湿基中所含的TE当量表示。整体而言，酸橙各部位的抗氧化活性主要由其游离酚贡献，各部位结合酚的DPPH和ABTS自由基清除能力及FRAP总抗氧化能力均显著弱于游离酚（p＜0.05）。酸橙果肉的游离酚DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力及FRAP总抗氧化能力均显著强于橙皮（p＜0.05），而橙籽的抗氧化能力最弱（p＜0.05）。Garau M等人［3］研究发现，酸橙干燥幼果果皮的抗氧化能力显著高于果肉。酸橙酚类物质的自由基清除活性与电子贡献能力有关，主要受B环羟基化和甲氧基化程度及位点影响，而邻苯二酚B环可能是重要的抗氧化特征结构，其幼果与成熟果实不同部位抗氧化能力强弱不同的物质基础有待进一步明晰。

3 结论

结合单因素试验和响应面试验，以多酚提取率为指标优化酸橙果肉酚类物质的提取工艺条件为料液比1∶16，乙醇体积分数46%，pH值2.5及浸提温度39℃。在此条件下，多酚的实际提取率为0.45%，与预测值的差异小于5%，回归模型拟合程度较好。各因素影响酸橙果肉多酚提取率的主次顺序为浸提温度＞pH值＞乙醇体积分数＞料液比。酸橙果实中酚类物质主要以游离态形式存在，且不同部位的酚类物质含量存在显著差异，其中游离酚含量以橙肉＞橙皮＞橙籽，而游离黄酮含量主次顺序为橙皮＞橙籽＞橙肉。橙肉具有相对较高的抗氧化能力，在抗氧化功能产品开发方面前景良好。

［1］易阳，王宏勋，何静仁.酸橙活性成分及其生理功效的研究进展 ［J］.湖北农业科学，2014，53（16）：3 721-3 725.

［2］Ou M.Chinese-English manual of common-used in traditional Chinese medicine［M］.Hong Kong：Joint Publishing Co.，1989：348-349.

［3］Garau M，Carme，Simal Susana，et al.Effect of air-drying temperature on physico-chemical properties of dietary fibre and antioxidant capacity of orange（Citrus aurantium V.Canoneta） by-products［J］.Food Chemistry，2007，104（3）：1 014-1 024.

［4］李青，张名位，张瑞芬，等.5种籼稻品种谷壳中游离态和结合态酚类物质含量及其抗氧化活性比较 ［J］.中国农业科学，2012，45（6）：1 150-1 158.

［5］孙杰，陆双双，徐燕燕，等.莲藕不同部位酚类物质含量、组成及抗氧化活性比较 ［J］.武汉轻工大学学报，2015，34（2）：20-25.◇

Study on the Extraction Technology Distribution and Antioxidant Activity of Phenolic Compounds from Citrus aurantium L.

JIANG Zhanmo，SUN Jie，*YI Yang，MIN Ting，WANG Limei
（College of Food Science&Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan，Hubei 430023，China）

This work aims to investigate the differences in the content and antioxidant activity of phenolic compounds from various parts of mature Citrus aurantium L.fruits.Base on signal-factor experiment，the extraction yield of phenolic compounds is used as response value to establish a regression model with four factors.Phenolic compounds from various parts of fruit are extracted for content measurement.Their compositions are detected by HPLC-MS method，and then DPPH and ABTS free radical scavenging capacities and FRAP total antioxidant capacity are evaluated.The optimized parameters for extracting phenolic compounds from Citrus aurantium L.pulp are confirmed as follows：material to liquid is 1∶16（g∶mL），

Citrus aurantium L.；phenolic compound；extraction；distribution；antioxidant activity

TS255.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.010

2015-12-01

武汉轻工大学引进人才科研启动项目（2013RZ03）。

蒋展沫（1992— ），男，本科，研究方向为农产品加工。

*通讯作者：易 阳（1986— ），男，博士，副教授，研究方向为农产品加工。

ethanol concentration is 46%，pH value is 2.5，and extraction temperature is 39℃.Under such conditions，the extraction yield of phenolic compounds reached to 0.45%.The phenolic compounds of the fruit mainly existed as free，the contents of free polyphenols in various parts are ordered as pulp＞peel＞seed，and the contents of free flavonoids are ordered as peel＞seed＞pulp.The antioxidant abilities of different parts，including DPPH and ABTS free radical scavenging capacities and FRAP total antioxidant capacity，could all be ordered as pulp＞peel＞seed.