住院患者产CTX-M型ESBLs和KPC的大肠埃希菌感染分布与耐药基因分析

蒋 伟, 王思淼, 金 鑫, 李佳佳

(解放军总医院第一附属医院，北京 100048)



·论著·

住院患者产CTX-M型ESBLs和KPC的大肠埃希菌感染分布与耐药基因分析

蒋 伟, 王思淼, 金 鑫, 李佳佳

(解放军总医院第一附属医院，北京 100048)

目的 了解住院患者产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和碳青霉烯酶(KPC)大肠埃希菌感染的临床分布与耐药情况。方法 收集某院2011—2012年临床送检标本分离的多重耐药大肠埃希菌，采用微量肉汤稀释法检测抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)；聚合酶链反应(PCR)扩增ESBLs和KPC基因，确定CTX-M和KPC基因型别及MLST分型。结果 48株多重耐药大肠埃希菌中单产ESBLs 45株(93.75%)，携带blaCTX-M基因者44株(91.67%)，其中blaCTX-M-1组基因20株(41.67%)、blaCTX-M-9组基因32株(66.67%)，同时携带两组基因者8株(16.67%)。经基因测序确定的基因亚型有CTX-M-14(65.91%，29/44)、CTX-M-55(31.82%，14/44)、CTX-M-15(11.36%，5/44)、CTX-M-3(2.27%，1/44)、CTX-M-24(2.27%，1/44)和CTX-M-65(2.27%，1/44)，其中CTX-M-14+CTX-M-55(11.36%，5/44)、CTX-M-14+CTX-M-15(4.55%，2/44)和CTX-M-55+CTX-M-65(2.27%，1/44)。产ESBLs+KPC菌株中2株(4.17%)经PCR扩增均携带blaKPC和blaCTX-M基因，经测序分析1株为CTX-M-14+KPC-2，1株为CTX-M-3+KPC-2。ST131 (53.66%)是主要的MLST型别，检测到ST648、ST405、ST167、ST1193等ST型。 结论 该院大肠埃希菌产ESBLs基因型中CTX-M-14、CTX-M-55和CTX-M-15亚型最常见，存在多种不同亚型；ST131是主要的MLST型别，检测到产KPC-2型碳青霉烯酶菌。

大肠埃希菌； 超广谱β-内酰胺酶； KPC酶； CTX-M； 多位点序列分析

[Chin J Infect Control，2016，15(10)：760-763]

产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase，ESBLs)和碳青霉烯酶(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase，KPC)等是引起大肠埃希菌多重耐药的主要原因，给临床治疗带来严峻挑战，已引起社会各界广泛关注[1-4]。不同地区、医院抗菌药物使用不同，产生的ESBLs和KPC基因型别亦不同[1-4]。本研究分析某院住院患者分离的产ESBLs和KPC大肠埃希菌引起的感染分布和耐药基因携带情况。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 菌株来源与鉴定 收集该院2011—2012年临床送检标本分离的多重耐药大肠埃希菌，标本来源于尿、血、引流液、脓液、穿刺液、脑脊液及胸腹腔积液，经Vitek Compact鉴定和药敏试验。

1.2 药敏试验 采用琼脂稀释法检测研究菌株的最低抑菌浓度(MIC)，根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)2013年标准，应用WHONET 5.6软件判断敏感、中介和耐药。对三类及三类以上抗菌药物耐药判断为多重耐药菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，阳性对照菌为大肠埃希菌ATCC 35218和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.3 产KPC酶表型检测 根据CLSI标准进行改良Hodge试验(MHT)及结果判读，筛选产KPC酶表型，阳性质控菌为产KPC-2型肺炎克雷伯菌(北京协和医院检验科，菌株编号K1)。

1.4 产ESBLs和KPC基因型检测 DNA提取采用煮沸法。PCR扩增CTX-M型ESBLs引物序列和反应条件参考文献[1]，KPC酶扩增引物序列和反应条件参考文献[3]。引物合成委托上海生工生物工程公司。

1.5 DNA测序 DNA测序委托上海生工生物工程公司，所得序列阅读和分析应用Chromas 2软件，结果比对通过Genbank中Blast，基因亚型确定参考Lahey系统 (www.lahey.org/studies/)。

1.6 MLST分型 根据文献[1]合成7种看家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA)，与数据库对比并分析ST型别。MLST网址：http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Ecoli。

2 结果

2.1 菌株分布 共分离48株多重耐药大肠埃希菌。来源科室：重症监护病房(ICU)10株(20.83%)，外科病房18株(37.50%)，内科病房19株(39.58%)，急诊科1株；标本来源：尿21株(43.75%)，血18株(37.50%)，胆汁、腹腔积液和脓液各2株(各占4.17%)，引流液、脑脊液、穿刺液各1株(各占2.08%)；年龄17～91岁，平均年龄(61.6±14.0)岁，60岁以上占58.33%；感染患者基础疾病包括：恶性肿瘤(胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、血液病等)、心脑血管疾病(心肌梗死、脑梗死等)、肾脏疾病(肾积水、泌尿系统感染，包括膀胱炎等)和外科手术(骨折切开内固定术、肾切除术后、胆囊切除术后等)。

2.2 细菌耐药情况 48株多重耐药大肠埃希菌中有45株单产ESBLs菌株，对亚胺培南、美罗培南、厄他培南、替加环素和多粘菌素100.00%敏感；对阿米卡星敏感率为91.11%，对哌拉西林/他唑巴坦的敏感率较高，为82.22%。45株单产ESBLs菌株对头孢曲松和头孢噻肟耐药率为100.00%，对环丙沙星、头孢吡肟、复方磺胺甲口恶唑的耐药率分别为91.11%、86.67%、86.67%。3株同时产ESBLs和KPC菌株除对阿米卡星、替加环素、多粘菌素敏感外，对其他所有检测抗菌药物均表现为耐药。见表1。

表1 45株单产ESBLs大肠埃希菌对常用抗菌药物的药敏结果(%，株)

Table 1 Antimicrobial susceptibility testing result of 45 ESBLs-producingE.coliisolates (%，No. of isolates)

抗菌药物敏感中介耐药哌拉西林/他唑巴坦82.22(37)2.22(1)15.56(7)头孢他啶28.89(13)17.78(8)53.33(24)头孢曲松0.00(0)0.00(0)100.00(45)头孢噻肟0.00(0)0.00(0)100.00(45)头孢吡肟6.67(3)6.67(3)86.66(39)头孢哌酮/舒巴坦57.78(26)17.78(8)24.44(11)氨曲南15.56(7)17.78(8)66.67(30)亚胺培南100.00(45)0.00(0)0.00(0)美罗培南100.00(45)0.00(0)0.00(0)厄他培南100.00(45)0.00(0)0.00(0)阿米卡星91.11(41)4.44(2)4.44(2)替加环素100.00(45)0.00(0)0.00(0)米诺环素62.22(28)15.56(7)22.22(10)左氧氟沙星15.56(7)6.67(3)77.78(35)环丙沙星6.67(3)2.22(1)91.11(41)复方磺胺甲口恶唑13.33(6)0.00(0)86.67(39)多粘菌素100.00(45)0.00(0)0.00(0)

2.3 基因型别检测结果 PCR扩增结果显示，48株多重耐药大肠埃希菌携带blaCTX-M基因者占91.67%(44株)，携带blaCTX-M-1组基因者41.67%(20株)、blaCTX-M-9组基因者66.67%(32株)，同时携带两组基因者占16.67%(8株)。44株携带blaCTX-M基因的大肠埃希菌中，确定的基因亚型有CTX-M-14(65.91%，29株)、CTX-M-55(31.82%，14株)、CTX-M-15(11.36%，5株)、CTX-M-3(2.27%，1株)、CTX-M-24(2.27%，1株)和CTX-M-65(2.27%，1株)，其中检测到CTX-M-14+CTX-M-55(11.36%，5株)、CTX-M-14+CTX-M-15(4.55%，2株)和CTX-M-55+CTX-M-65(2.27%，1株)。见表2。ESBLs+KPC菌株中2株(4.17%)经PCR扩增均携带blaKPC和blaCTX-M基因，经测序分析1株为CTX-M-14+KPC-2，1株为CTX-M-3+KPC-2。

2.4 MLST分型结果 48株菌均进行了MLST分型，其中能明确分型者41株，主要包括CTX-M-15型、CTX-M-55型和CTX-M-14型。其中ST131(53.66%，22株)为最主要ST型, 其次为ST1193(21.95%，9株)和ST648(19.51%, 8株)，ST405 (2.44%，1株)和ST167(2.44%，1株)。CTX-M-14 基因型中以ST131 (58.33%，14/24)为主，其次为ST648(33.33%，8/24)；CTX-M-55 基因型以ST1193(64.29%，9/14)和 ST131(35.71%，5/14)为主，而CTX-M-15基因型检测到ST405(20%，1/5)、ST167(20%，1/5)和ST131(60%，3/5)。各ST型别分布于不同时期的不同病房，均为散发分布，未发现暴发流行趋势。见表2。

表2 44株产CTX-M型ESBLs大肠埃希菌基因型、MLST型别及标本来源分布(株)

Table 2 Distribution of CTX-M genotypes, MLST types, and sources of specimens of 44 ESBLs-producingE.coliisolates (No. of isolates)

基因型菌株数标本来源尿血胆汁腹腔积液脓液脑脊液穿刺液MLST分型CTX-M-1群 CTX-M-5582500010ST1193,ST131 CTX-M-1531200000ST405,ST167,ST131 CTX-M-311000000未分型CTX-M-9群 CTX-M-142210721101ST131,ST648 CTX-M-6511000000未分型 CTX-M-2410000100未分型CTX-M-1群+CTX-M-9群 CTX-M-55+CTX-M-1454100000ST131,ST1193 CTX-M-15+CTX-M-1420101000ST131 CTX-M-55+CTX-M-6510100000ST1193合计44191722211

3 讨论

CTX-M即头孢噻肟酶，呈全球性分布，世界各地均有报道[1-2, 5-10]。我国CTX-M检出率居高不下[1,5,8-10]。本研究显示，该院CTX-M基因的总检出率为91.67%，主要携带CTX-M-1基因(占41.67%)和CTX-M-9组基因(占66.67%)，且携带的CTX-M-9组基因检出率更高，而同时携带两组基因者占16.67%，高于我国以往的报道[8]。其中主要流行基因亚型为CTX-M-14、CTX-M-55和CTX-M-15，与国内报道[1]一致。CTX-M-55和CTX-M-15的检出率呈上升趋势，CTX-M-14目前仍是该院主要的ESBLs亚型。CTX-M-55被认为是动物源性亚型，是由CTX-M-15在第77位发生Ala-Val氨基酸改变而来。同样，CTX-M-65和CTX-M-24也被称为食品动物源性，在该院临床标本中亦有少量检出。

研究[11]证实，高产ESBLs可导致碳青霉烯类抗菌药物耐药性上升。该院大肠埃希菌碳青霉烯类耐药的原因可能与产KPC酶菌同时携带ESBLs相关，而非单一因素所致。

药敏结果显示，所有产ESBLs大肠埃希菌对亚胺培南、美罗培南、厄他培南、替加环素、多粘菌素、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦的敏感性较高，与国内报道[12]一致，可作为治疗该类感染的首选药物。但碳氢霉烯类抗生素不敏感菌株的出现是临床抗感染治疗的难题，临床应注意监测。本组结果显示，产KPC菌株对阿米卡星、替加环素、多粘菌素敏感性高，可作为严重感染者的用药选择。

MLST分型结果显示，ST131是该院多重耐药大肠埃希菌的主要型别(占53.66%)，在CTX-M-15 、CTX-M-55和 CTX-M-14基因型中均有检出，分布于不同时期的不同病房，未出现暴发流行趋势。而ST1193主要在CTX-M-55型大肠埃希菌中检出，ST648在CTX-M-14型大肠埃希菌中检出，同时检出ST405和ST167，也说明该院存在多种ST型别的散在分布。本组未进行质粒接合实验和PFGE分型，是否存在质粒的传播播散需进一步证实。

研究[13-14]显示，临床上产ESBLs和KPC酶的肠杆菌科细菌感染病例日益增多，入住ICU、住院时间长(≥7 d)、留置各种导管、严重基础疾病、机械通气、年龄≥60岁等均是导致患者发生感染的危险因素。本组产CTX-M型ESBLs和KPC的大肠埃希菌来源于多种临床标本和多个科室，感染患者年龄分布广泛(17～92岁)，>60岁者占58.33%，提示住院患者中高危人群应引起临床和微生物室的重点监测和关注。从患者、菌株、各种酶基因型等不同方面加强产酶菌的检测和监测，采取有效的抗菌药物管理和控制，严格遵守无菌操作规范，阻断产ESBLs和KPC细菌的传播途径等综合干预措施[13-14]，以有效防止和减少产ESBLs和KPC细菌在医院内的产生和传播。

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(本文编辑：陈玉华)

Distribution and antimicrobial resistance genes of CTX-M extended-spectrum β-lactamase- andKlebsiellapneumoniaecarbapenemases-producingEscherichiacoliisolated from patients with infection

JIANGWei,WANGSi-miao,JINXin,LIJia-jia

(FirstAffiliatedHospitalofPLAGeneralHospital,Beijing100048,China)

Objective To investigate clinical distribution and antimicrobial resistance genes of CTX-M extended-spectrum β-lactamases (ESBLs)- andKlebsiellapneumoniaecarbapenemases (KPCs)-producingEscherichiacoli(E.coli) isolated from patients with infection. Methods Multidrug-resistantE.coli(MDR-E.coli) isolated from clinical specimens in a hospital in 2011-2012 were collected, minimal inhibitory concentrations (MICs) were detected by micro-broth dilution method; ESBLs and KPC genes were amplified by polymerase chain reaction (PCR), CTX-M and KPC genotypes，as well as multilocus sequence types (MLST) were identified. Results Of 48 MDR-E.coli, 45(93.75%) only produced ESBLs, 44(91.67%) carriedblaCTX-Mgene, 20(41.67%) of which wereblaCTX-M-1gene and 32(66.67%)wereblaCTX-M-9gene，8(16.67%)carried both genes. The following subtypes were identified through gene sequencing: CTX-M-14(65.91%，29/44), CTX-M-55(31.82%，14/44), CTX-M-15(11.36%，5/44), CTX-M-3(2.27%，1/44), CTX-M-24(2.27%，1/44),and CTX-M-65(2.27%，1/44). The detection rates of CTX-M-14+CTX-M-55, CTX-M-14+CTX-M-15, and CTX-M-55+CTX-M-65 were 11.36% (5/44), 4.55%(2/44), and 2.27%(1/44)respectively. PCR showed that 2(4.17%) ESBLs+KPC-producing strains carriedblaKPCandblaCTX-Mgenes, sequencing analysis showed that 1 was CTX-M-14+KPC-2，and the other was CTX-M-3+KPC-2. ST 131 (53.66%)was the main type of MLST, ST648, ST405, ST167, and ST1193 were also detected. Conclusion CTX-M-14, CTX-M-55 and CTX-M-15 are the most common genotypes of ESBLs-producingE.coliisolates, different subtypes exists, ST131 is the predominant MLST, KPC-2-producing isolate ofE.colihas been detected.

Escherichiacoli; extended-spectrum β-lactamase;Klebsiellapneumoniaecarbapenemase; KPC; CTX-M; multilocus sequence typing

2016-01-28

蒋伟(1968-)，女(汉族)，江苏省南京市人，副主任技师，主要从事感染性疾病防控与细菌耐药研究。

蒋伟 E-mail:jiangwei680808@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.10.010

R181.3+2

A

1671-9638(2016)10-0760-04