滩羊多胎品系选育中的FecB 基因的检测及利用

额尔和花　谢秀兰 马丽娜 岳彩娟 丁 伟

（宁夏农林科学院草畜工程技术研究中心，宁夏银川 750002）

滩羊多胎品系选育中的FecB 基因的检测及利用

额尔和花谢秀兰 马丽娜 岳彩娟 丁 伟

（宁夏农林科学院草畜工程技术研究中心，宁夏银川 750002）

为了达到滩羊多胎品系的辅助选育的目的，试验利用绵羊多胎主效基因FecB 的PCR-RFLP 检测方法检测了宁夏灵武、盐池两地滩羊多胎品系基础群湖羊母本及其滩湖杂一代252只个体，检测结果为湖羊母羊公羊169只均为BB型，滩公羊4只均为++型，滩湖杂一代80只为B+基因型，其中BB型66.7%；B+型31.75%；++型1.98%，并确定了每个个体的基因型，通过基因型的判断在选配中选留BB基因型和B+基因型，进一步纯化基因达到滩羊多胎品系选育的目的，可加速育种项目滩羊多胎品系的选育步伐。

滩羊品系选育FecB基因

FecB基因是在绵羊中识别出的第一个高繁殖力主效基因。家畜的产仔（羔）数是经济价值十分巨大的数量性状，对绵羊产羔数的选择不仅受到性别和年龄的限制，而且绵羊的产羔数是一个遗传力很低的数量性状，难以用常规的育种技术来改良产羔数性状。王根林等和柳淑芳[1］[2］等相继分别报道了湖羊和小尾寒羊存在FecB基因，即BM PR-IB基因突变，湖羊是我国著名的多胎品种之一，育种学家们早就关注了湖羊的多胎性，湖羊最早育成于太湖流域及周围地区，以产羔率高和盛产优质羔皮而著称，而滩羊是我国特有的轻裘皮用单羔绵羊品种，所产的二毛裘皮以质地轻软、花穗图案清晰美丽、滩羊肉以肌肉纤维密、脂肪分布均匀、含量适中、组织含水量较高、嫩香、无膻味而闻名海内外，但是繁殖力低下是限制滩羊生产性能的主要因素之一，为了合理利用滩羊的种质特性，同时发挥湖羊多胎高产的优势，以滩羊为父本湖羊为母本，将传统的常规表型选择育种和FecB基因分子标记辅助选择育种技术相结合，开展了新品种（系）培育工作，本研究应用PCR-RFLP方法对湖羊母本及滩湖杂交后代进行了多胎主效基因FecB检测，以期加速滩羊多胎品系的选育步伐。

1　材料与方法

1.1样品采集和DNA提取

湖羊母本及滩湖杂交后代样品分别采自宁夏灵武、盐池两地滩羊多胎品系基础群共252只，每只绵羊颈静脉采血2～5 ml，柠檬酸葡萄糖抗凝，颠倒混匀以防止血液凝固，低温（4℃以下）带回实验室，分装后-80℃长期冻存。冷冻血液在室温融化后，取700μl移至1.5ml 离心管中，应用血液DNA提取试剂盒（天根生物技术有限公司）提取血液基因组DNA，0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测总DNA，并用核酸浓度测定仪测定其浓度和纯度，在- 20℃以下的低温保存备用。

1.2引物序列

引物序列参照储明星[3][4］等文献报道的绵羊多胎主效基因FecB分子检测方法，预期扩增产物大小为140 bp。

上游引物：5'-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3'；

下游引物：5'-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3'。

1.3PCR 扩增

PCR 扩增体系：PCR 扩增反应总体积为25 μl，其中2×Taq PCR master Mix 12.5 μl，10 μmol/L 上下游引物各1.0 μl，去离子水10.5 μl。PCR 扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33 个循环；72 ℃延伸5min，4 ℃保存。PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4PCR产物的酶切检测

RFLP 酶切体系：PCR 扩增产物用AvaⅡ限制性内切酶进行酶切，酶切反应总体积为15μl，其中PCR 产物5 μl，10×缓冲液1.5 μl，10U/μl Ava Ⅱ限制性内切酶1.0 μl，去离子水7.5μl。振荡、短暂离心（转速达12 000 r/min 即可），酶切反应条件为37℃水浴4 h。RFLP 产物琼脂糖凝胶电泳检测：酶切产物用3.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

2　结果与分析

2.1PCR扩增产物及酶切检测

用引物对绵羊基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物仅出现140bp 条带（图1，A），扩增特异性较好，并进行了进一步的酶切检测。

图1　FecB 基因PCR电泳图

图2　FceB基因的PCR-RFLP电泳检测图

2.2RFLP检测

用Ava Ⅱ限制性内切酶对不同个体PCR 扩增产物进行酶切，结果检测出3 种基因型（++、B+ 和BB），如图2所示（110 /110 bp）条带表示为2 个FecB 拷贝的携带者，即BB 型，纯合子个体；（140 /110 bp）两条带表示为1 个FecB 拷贝的携带者，即B+ 型，杂合子；FecB 拷贝的非携带者（140 /140 bp），即++ 型。

2.3检测结果

利用绵羊多胎主效基因FecB 的PCR-RFLP 检测方法检测了宁夏灵武、盐池两地滩羊多胎品系基础群湖羊及其滩湖杂一代252只，等位基因和基因型概率如表1所示，其中BB型66.7% （168/252）；B+型31.75%（80/252）；++型1.98%（5/252）。

表1　酶切检测结果

3　结论与讨论

为了滩羊多胎品系的选育，课题组对选育杂交母本湖羊以及滩湖杂一代进行了FecB检测。FecB是在布鲁拉美利奴（Booroola Merino）绵羊中发现的能增加排卵数和产羔数的一个常染色体突变基因（Davis et al.，1982；Piper and Bindon，1982），携带FecB 基因的绵羊其高繁殖力是BMPR-IB基因突变的结果，FecB 即BMPR-IB 基因的746G 或249R，Fec+即BMPR-IB 基因的746A 或249Q[3-5］，这为绵羊多胎基因FecB 的检测提供了直接的分子标记。

利用PCR-RFLP 方法对滩羊多胎品系基础群进行FecB基因检测，结果为湖羊母羊公羊169只均为BB型，滩公羊4只均为++型，滩湖杂一代80只为B+基因型，通过基因型的判断在滩羊多胎品系选育中多选留携带高繁殖力基因FecB的BB基因型和B+基因型的母羊和公羊选配，有利于绵羊多胎基因频率的提高和基因型的纯化，实现早期快速、准确的预测绵羊产羔情况，达到辅助育种的目的。据报道[6］在绵羊群体中导入多胎基因，能够显著提高单位母羊存栏羔羊总重，在实际绵羊生产中，多产羔与单位母羊总产肉贡献率成正比，多胎性能是绵羊高产的基础，也是提高绵羊养殖经济效益的最重要的因素之一，因此，世界主要养羊国对绵羊多胎基因的研究特别重视，通过标记辅助导入湖羊的多胎基因培育滩羊新品系是提高滩羊产肉率和生产性能的有效途径。因此，在选育中要继续加强多胎基因检测，以确保多胎基因的纯化，促进育种进程。

[1]王根林.DNA 分析发现我国湖羊和小尾寒羊存在 Booroola （FecB）多胎基因[J］.南京农业大学学报，2003，26（1）：104-106.

[2]柳淑芳.BMPR - IB 和 BMP15 基因作为小尾寒羊多胎性能候选基因的研究[J］.遗传学报，2003，30（8）：755- 760.

[3]储明星，狄冉.绵羊多胎主效基因FecB 分子检测方法的建立与应用[J］.农业生物技术学报，2009，17（1）：52-58.

[4]额尔和花，黄顺国，丁伟，等.滩羊及其杂改群体中 BMPR—IB基因的研究[J］.宁夏农林科技，2009，（3）：6-7.

[5]黄顺国，额尔和花，王新燕，等.绵羊多胎基因BMPR-IB，BMP15的研究进展[J］.农业科学研究，28（3）：68-71.

宁夏回族自治区育种专项项目，编号2013NYYZ0404，宁夏农林科学院先导项目，编号，NKYJ-14-09

额尔和花（1973-），女，内蒙古赤峰市人，硕士学历，副研究员，主要从事畜禽养殖业及遗传育种方面的研究。

丁伟（1971-），男，宁夏银川市人，本科学历，副研究员，研究方向：畜禽养殖业及遗传育种。