NKA1B2基因intron2上C2343T与产奶性状的关联分析

付忠华　辛立卫　张春光　陈永刚　刘 月

（梨树县兽药监察所，吉林梨树　136500）

NKA1B2基因intron2上C2343T与产奶性状的关联分析

付忠华辛立卫张春光陈永刚刘 月

（梨树县兽药监察所，吉林梨树136500）

本研究通过DNA测序和PCR-SSCP分型对930头荷斯坦牛的NKA1B2基因进行群体遗传学分析并测定产奶高峰期的产奶性能指标及体细胞数。在第2内含子检测到新的SNP，C2343T位点存在两种等位基因（C和T）和三种基因型（CC、CT、TT），都处于Hardy-Weinberg非平衡（P＜0.05）。C2833T位点的SNP对乳蛋白率存在极显著影响（P＜0.01），对305 d产奶量存在显著影响（P＜0.05）。基因T替代C对乳脂率、305天产奶量和体细胞评分都具有正效应，对乳蛋白率具有负效应。TT基因型个体产奶量下降率低，乳腺炎抵抗力高的优良特征。

Na+-K+-ATP酶基因多态性产奶性能指标体细胞数

Na+-K+-ATP酶（NKA），是一类广泛存在于真核生物细胞膜上的跨膜载体蛋白，是细胞内离子转运和能量代谢的重要系统，直接或间接地参与细胞内外的离子调节，机体的生理活动和体温调节过程[1，2］。P. Vague研究发现，细胞内Na+和K+的平衡主要有NKA来调节，NKA活性的降低可引起细胞的离子跨膜转运障碍，能量代谢和物质代谢的紊乱[3］。多位学者证实在炎热的夏季，持续高温造成的热应激可导致奶牛直肠温度、呼吸频率、红细胞钾、产奶量发生明显的变化[4-7］。研究发现，荷斯坦牛红细胞NKA活力与产奶量下降率极显著负相关[8-9］。在本研究中，我们对荷斯坦牛NKA1B2基因内含子2上的SNP进行群体遗传学分析，从多态性、基因效应分析对产奶性状的影响以及对体细胞数的变化，以其为荷斯坦牛的选育提供理论依据和参考指标。

1　材料和方法

1.1试验动物

从规模化奶牛场中随机挑选具有完整DHI记录（乳脂率、乳蛋白率、305天产奶量及体细胞数）的同一胎次中国荷斯坦牛930头。所有生产数据通过Foss 6000乳成分及体细胞联机分析系统（Foss MilkScan FT 6000，Fossmatic 5000）检测获得。静脉采血（10mL/头），ACD抗凝，-20℃保存。

1.2NKA1B2的SNP检测

根据牛NKA1B2基因全序列（NCBI登录号：NC_007317-2），使用Primer5.0软件，设计2对引物，由上海生工合成（见表1）。然后以DNA池为模板，按照（PCR反应体系均为25μl，包括10×buffer 2.5μl，25 mmol/L Mg2+1.8μl，10 mmol/L dNTPs 0.5μl，10μmol/L上、下游引物各0.8μl，模板DNA 1.0μl，5 U/μl Taq DNA 聚合酶0.5μl，三蒸水17.1μl。PCR扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，退火（退火温度见表1）30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min）PCR体系进行反应，PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送到北京华大进行测序。

表1　引物设计

1.3NKA1B2基因分型

用PCR-SSCP来进行基因分型，方法是把6μlPCR产物加入25μl离心管中，然后再加入9μl变性剂（95%甲酰胺，25 mM EDTA，0.025%二甲苯青，0.025%溴酚蓝），98℃变性10min，迅速冰浴5min。变性的DNA用10%PAGE电泳（80×73×0.75 mm），1×TBE buffer，稳压（120V），4℃，电泳10-14h，用0.1%硝酸银进行染色，根据PCR-SSCP电泳结果判断每一个体的基因型。

1.4数据的统计分析

统计中国荷斯坦奶牛的基因频率和基因型频率，计算χ2值、多态信息含量（PIC）、有效等位基因数（Ne）和位点的杂合度（H）。在最小二乘法拟合线性模型中用SPSS13.0软件比较中国荷斯坦奶牛的乳脂率、乳蛋白率、305天产奶量、体细胞评分（SCS）在不同基因型之间的差异。分析中使用固定效应的线性模型是：Yijkil=u +hi+pj+sk+ml+eijkli（其中：Yijkli=耐热性能观察值；u =群体均值；hi=基因型的固定效应值；pj=父本的固定效应值；sk=母本的固定效应值；ml=产奶性能效应值；eijkli=随机残差效应）。结果以“平均数±标准误”的形式表示。

1.5体细胞评分（SCS）计算

公式是SCS=log2（SCC/ 100）+ 3

1.6基因频率（P）和基因型频率（Pi）的计算

公式是p =（2a + c）/2N、q =（2b + c）/2N、pa=a/N、pb=b/ N、pc=c/N。其中p、q是A、B两个等位基因频率，pa、pb、pc是AA、AB、BB三种基因型频率。a为AA基因型个体数，b为BB基因型个体数，c为AB基因型个体数，N为总体个数。

1.7Hardy-Weinberg平衡定律的适合性χ2检验

公式是χ2=[∑（O-E）2］/E。其中O是实际发生数，E是理论发生数。

1.8遗传群体杂合度（H）的计算

1.9多态信息含量（PIC）的计算

1.10有效等位基因数（Ne）的计算

1.11基因替代效应的计算

公式是显性效应：d=AB-（AA+BB）/2；加性效应：a=（BBAA）/2；显性度D=d/a。A基因的平均效应：a1=q[a+d（q-p）］；B基因的平均效应：a2=-p[a+d（q-p）］。A等位基因替代B等位基因的平均效应a=a1-a2=a+d（q-p）。其中p是A等位基因频率，q是B等位基因频率，AA、AB、BB是各基因型的最小二乘均值。

2　试验结果

2.1扩增产物电泳，测序和分型

PCR扩增经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，都产生了清晰的、能够准确判断的目的条带1438bp和340bp，随机抽取部分样本进行两次重复测序，同时发现第2内含子的C2343T突变，通过PCR-SSCP分型，发现三种基因型CC、CT和TT，见图1。

图1　NKA1B2基因的C2343T位点特征

2.2群体遗传学分析

PCR-SSCP检测到C2343T位点具有两个等位基因（C、T），三种基因型（CC、CT、TT），等位基因频率和基因型频率、多态信息含量（PIC）、杂合度（H）、有效等位基因数（Ne）、卡方（χ2）见表2。

表2　C2343T在荷斯坦牛群体中的遗传多样性

2.3NKA1B2不同基因型与产奶性状的相关分析

由表3可知，荷斯坦牛NKA1B2基因C2343T位点SNP在乳蛋白率上TT基因型个体极显著高于CC和CT基因型个体，在305天产奶量上CT基因型个体显著高于TT基因型个体。

表3　NKA1B2基因不同基因型的产奶性状的最小二乘均值和标准误

2.4NKA1B2基因产奶性状的基因效应值

由表4可知，荷斯坦牛NKA1B2基因C2833T位点的SNP由基因T替代C可以使乳脂率提高0.038，乳蛋白率降低0.253，305天产奶量提高350.866，体细胞评分提高0.016。

表4　NKA1B2基因的C/T替代效应

3　讨论

研究发现荷斯坦奶牛C2343T的突变位于内含子，归巢时可能在基因的转录及mRNA剪切中调节DNA分子的移动[10，11］。该位点的等位基因频率和基因型频率在群体内差异明显，C 等位基因频率大于0.5，在荷斯坦牛群中的纯合性较好；该位点的PIC在0.25到0.5之间，属于中度多态，变异程度较大，有望获得更多的遗传进展；该位点的H比较低，在群体内的遗传变异较小，基因资源和遗传多样性不够充足和丰富；该位点的Ne比较低，群体在发生选择、突变或遗传漂变时，群体保持其等位基因的能力较差；χ2检验，该位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态，基因频率和基因型频率在世代遗传中将发生改变，不能处于遗传平衡状态。这些结果与品种（群体）的起源演化、育种历史及所处生态条件有关，可能原因是：①试验群体较小。②全球性的乳用型荷斯坦牛在自然和人工选择的作用下，由于生长的自然生态环境和社会经济条件的不同，遗传结构已发生了较大的突变和变异，形成了不同的生态品种——中国荷斯坦牛。③进口的冷冻胚胎和种公牛迁移进入中国荷斯坦牛群体中，彼此掺入外来基因，导致基因流动，改变了中国荷斯坦牛群体的基因频率。④对优良种公牛的高度选择和冷冻精液定性分离以及人工授精技术的应用，有选择性地打破了群体的随机交配。

研究显示在荷斯坦牛群中，CT基因型在乳脂率和305天产奶量上具有优势，TT基因型在乳蛋白率上具有优势；T等位基因对乳脂率、305天产奶量和体细胞评分具有正效应，对乳蛋白率具有负效应。SNP对产奶性状影响不同的原因可能是：①样本量差异导致基因型数量上的差异。②承受的人工选择压力不同导致环境适应性的差异。③饲料来源和饲养模式造成产奶性状的差异。④特殊经济性状的选择差异。SNP对产奶性状的影响和基因替代效应都表明在生产实践中不能同时提高所有的产奶性状[12，13］。所以CT基因型个体，T基因型个体在试验的牛群中分布频率都不高，因此在生产中，根据不同的生产目的，及早干预有利基因型在荷斯坦奶牛群体中的频率，加快高乳蛋白或高乳脂的荷斯坦牛群的组建。

4　结论

本研究测序发现中国荷斯坦牛NKA1B2基因的第2内含子存在新的SNP位点C2343T，PCR-SSCP分型发现3种基因型CC、CT和TT，都与产奶性状及体细胞数存在相关，且TT基因型个体相对具有优越的产奶性能和良好的乳腺炎抵抗性。因此，NKA1B2基因C2343T可能作为荷斯坦牛产能性能评定的分子遗传标记，但仍需加大样本量和试验研究论证。

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