可视化蛋白芯片法同时检测牛乳中残留的磺胺类和喹诺酮类药物

钟文英，王兴如，许丹科，李钟卉，李周敏

（1.中国药科大学理学院分析化学教研室，江苏 南京 211198；2.南京大学化学化工学院，生命分析化学国家重点实验室，江苏 南京 210093）

可视化蛋白芯片法同时检测牛乳中残留的磺胺类和喹诺酮类药物

钟文英1，王兴如1，许丹科2,*，李钟卉2，李周敏2

（1.中国药科大学理学院分析化学教研室，江苏 南京 211198；2.南京大学化学化工学院，生命分析化学国家重点实验室，江苏 南京 210093）

目的：利用可视化蛋白芯片分析技术对牛乳中磺胺类和喹诺酮类抗生素多残留的同时检测。方法：采用间接竞争法反应原理，将磺胺类和喹诺酮类药物的人工抗原以微阵列形式固定于微孔板底部，制备成微孔板生物芯片阵列，并依次与磺胺类和喹诺酮类单克隆抗体、纳米银标记羊抗鼠IgG反应，最后用纳米银增强法显色，并采用可视化芯片扫描仪对微孔板显色结果进行快速扫描成像，图像采用芯片分析软件处理。结果：本法磺胺嘧啶和恩诺沙星线性范围为分别为0.3～7.2 ng/mL和0.4～18 ng/mL。空白牛乳中加标磺胺嘧啶（0.5、2.0、5.0 ng/mL）和恩诺沙星（0.5、3.0、15.0 ng/mL），结果牛乳中2 种药物的加标回收率分别为83%～110%，且相对标准偏差均在10%以内。结论：本法能够用于牛乳样本中磺胺类和喹诺酮类药物的残留的快速初筛。

蛋白质芯片；间接竞争法；多残留检测；磺胺类药物；喹诺酮类药物

为了控制动物疾病的发生，养殖过程中会有多种药物同时或交替使用的情况，这就导致了药物多残留的发生。磺胺类和喹诺酮类药物均为广谱抗菌药，常被用于奶牛养殖业中。但是过量使用会导致其在奶牛体内蓄积，进而残留在牛乳中，最终会影响人类的健康。磺胺类药物的半衰期较长，容易在人体中蓄积而对人体产生很多危害，如药物过敏性反应、影响造血系统、损伤泌尿系统和耐药性[1]。喹诺酮类药物会对中枢神经系统消化道反应、过敏反应、血液系统造成不良反应[2]。因此，很多国家对磺胺类和喹诺酮类药物的使用及其在动物源性食品中的残留做了严格的规定。我国农业部2002年规定了兽用磺胺类药物最高残留限量100 μg/kg，牛、鸡、猪、羊、兔等动物的肌肉、脂肪、肝、肾食品中达氟沙星、恩诺沙星等喹诺酮类兽药最高残留限量10～1 900 μg/kg[3-4]。

磺胺类和喹诺酮类药物残留的分析方法[5-6]主要有免疫法[4]、微生物法[7-8]和色谱法[7,9]等。免疫法中酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定及胶体金试纸条技术作为一种快速、方便、低成本、高通量的筛选手段，广泛应用于众多领域，但是ELISA[6,8]只能检测单组分残留，而胶体金试纸条技术[7]容易出现高的假阳性率或假阴性率。微生物法的优点是操作简便、成本低、检测快速，但灵敏度不高，特异性差。色谱法然精确，但是存在设备昂贵、技术操作复杂、前处理繁锁、检测时间长及费用高等缺点，决定其不适于大规模的现场快速检测。蛋白芯片法具有高通量、检测时间短、特异性高、操作简单、成本低等优点，在国内外的研究中被广泛应用于临床监测、食品监测、病毒监测等领域[10-23]。

本研究建立了一种可同时检测牛乳中磺胺类和喹诺酮类药物多残留的可视化蛋白芯片法通过对抗原质量浓度、抗体质量浓度、纳米银标记羊抗鼠IgG用量等条件的优化，考察了方法的检出限、回收率和线性范围等，获得了良好的分析结果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

磺胺类单克隆抗体、磺胺类人工抗原、磺胺嘧啶对照品（USP Grade）、喹诺酮类单克隆抗体、喹诺酮类人工抗原、恩诺沙星对照品（USP Grade）、纳米银标记的羊抗鼠IgG、纳米银增强显色液 南京祥中生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

点样仪 清华大学自主研制；Q-array2000可视化生物芯片扫描仪、多管涡旋混旋仪、恒温孔板振荡仪 南京祥中生物科技有限公司；KQ218型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；单道可调移液器 苏州百得实验室仪器有限公司；微孔板 南京祥中生物科技有限公司；显色液A、显色液B 美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 人工抗原的固定与封闭

本实验所用抗原为磺胺类-牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）和喹诺酮类-BSA偶联物。用生物芯片点样仪在96微孔板上根据需要制备不同规格的矩阵，分别点不同质量浓度的抗原，点样量为50 nL/点，每样分别重复3 个点，点样结束后，将芯片放于37 ℃恒温箱里孵育2 h，使人工抗原固定于板底。每孔加入200 μL的芯片封闭液（含1% BSA的0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（phosphate-buffered saline，PBS）），放于37 ℃恒温箱里孵育2 h，然后用0.1%的PBST（含Tween-20的PBS）洗3 次，每次10 s，拍干，置于4 ℃待用。

1.3.2 微孔板生物芯片的分析检测

制备好的板内每孔加入25 μL的磺胺嘧啶和恩诺沙星混合标准品和25 μL的磺胺类和喹诺酮类混合单克隆抗体，放于37 ℃恒温箱里孵育30 min，然后用PBST洗3 次，每次10 s，拍干。每孔加入50 μL的纳米银标记的羊抗鼠IgG，放于37 ℃恒温箱里孵育30 min，然后用PBST洗3 次，每次10 s，拍干。再在每孔加入50 μL的银增强显色剂（显色液A+显色液B体积比1∶1混合，现配现用），放于37 ℃恒温箱里孵育15 min，然后用PBST洗3 次，每次10 s，拍干。利用可视化生物芯片扫描仪进行扫描，并利用芯片分析软件进行结果处理分析。

1.3.3 牛乳样本前处理

取1 mL牛乳，加入6 mL乙酸乙酯，振荡（2 400 r/min，3 min），然后离心（4 500 r/min，15 min）后吸取上层有机层3 mL，氮吹。加入1 mL正己烷振荡（2 200 r/min，5 min），再加入500 μL复溶液振荡（2 000 r/min，5 min）。转入2 mL离心管中，离心（12 000 r/min，10 min），弃去上层有机相，取下层水相用于实验。

2 结果与分析

2.1 抗原抗体质量浓度优化

采用正交试验法优化。分别固定质量浓度为2.8、1.4、0.7、0.35 mg/mL磺胺类的抗原和质量浓度为3.6、1.8、0.9 mg/mL喹诺酮抗原，磺胺类单克隆抗体质量浓度为800、400、200、100 ng/mL，喹诺酮单克隆抗体的质量浓度为1 000、500、250、125 ng/mL。结果表明，抗原稀释度增加孔内及孔间变异系数（coefficient of variation，CV）均会变大。低质量浓度抗体时灵敏度高，但是信号值偏低，会造成孔内CV会变大。检测信号灰度值随抗体质量浓度增大而增大，但抗体质量浓度过高时，信号饱和而使竞争失去意义，在综合考虑检测精密度和灵敏度的基础上，最终确定磺胺类抗原质量浓度为0.7 mg/mL，抗体质量浓度为400 ng/mL，喹诺酮类抗原质量浓度为1.8 mg/mL，抗体质量浓度为500 ng/mL（表1、2）。

表1 磺胺类抗原抗体筛选Table 1 Screening of sulfonamides antigen and antibody

表2 喹诺酮类抗原抗体筛选Table 2 Screening of quinolones antigen and antibody

2.2 纳米银标记的羊抗鼠IgG工作浓度的优化

筛选浓度为1∶50、1∶100、1∶200、1∶400的纳米银标记的羊抗鼠IgG。纳米银标记羊抗鼠IgG的量在这个体系中不是决定性的因素，但浓度过小会导致检测信号偏弱，增大了系统的误差。结合实验结果确定纳米银标记羊抗鼠IgG选1∶100稀释度，可以得到较为满意的实验结果。

2.3 纳米银催化显色剂显色时间的优化

将银增强显色剂A液与B液按照体积比1∶1混合，每孔加入50 μL，分别显色10、15、20 min。显色过程中随显色时间的延长，0～10 min内信号值变化很小，10～15 min信号值缓慢增加，15 min以后信号值明显增加，且孔板中溶液的颜色不断加深，造成背景值也明显的增加，信噪比降低。显色10 min时，虽然背景信号值很低，信噪比较高，但是点阵的信号值偏低，综合考虑，选择信噪比较高的15 min为最佳显色时间。

2.4 磺胺类和喹诺酮类特异性实验

用间接竞争法分别测定抗磺胺类单克隆抗体与磺胺类药物、抗喹诺酮类单克隆抗体与喹诺酮类药物的交叉反应性，计算交叉反应率。

交叉反应率/%=（50%抑制磺胺嘧啶（恩诺沙星）的质量浓度/50%抑制磺胺（喹诺酮）类似物的质量浓度）×100

结果表明抗磺胺类抗体与9种磺胺类药物、抗喹诺酮类抗体与8种喹诺酮类药物的交叉反应率都达50%以上（表3）。

表3 抗磺胺类和喹诺酮类抗单克隆抗体的交叉反应率Table 3 Cross-reactivity of monoclonal antibodies against sulfonamidesand quinolones

2.5 磺胺类和喹诺酮类抗原抗体的特异性反应

通过将磺胺类抗体与喹诺酮抗原和不同质量浓度（0、1、18、40 ng/mL）恩诺沙星做交叉反应，以及喹诺酮类抗体与磺胺类抗原和不同质量浓度磺胺嘧啶（0、1.8、7.2、20 ng/mL）的交叉反应。结果如表4和5所示，磺胺类和喹诺酮类抗原抗体之间具有特异性反应，相互之间基本无交叉反应。

表4 磺胺类抗原抗体的特异性反应Table 4 Specificity of antibody against sulfonamides antigen

表5 喹诺酮类抗原抗体的特异性反应Table 5 Specificity of antibody against quinolones antigen

2.6 磺胺类和喹诺酮类二合一标准曲线的建立

探索磺胺类和喹诺酮类标准曲线采用间接竞争法。每个抗原质量浓度点印3 个平行微阵列点，信号值取其平均值。在一定范围内，随着竞争对照品质量浓度的增大，固定的人工抗原结合的抗体会越来越少，与其相结合的纳米银标记羊抗鼠IgG的量也将随之减少，因而检测到的灰度值信号就越低，超过这个范围，检测灰度值不随竞争对照品的增大而变化。磺胺嘧啶对照品（0、0.3、0.9、1.8、3.6、7.2 ng/mL）与恩诺沙星对照品（0、0.4、1.0、2.4、6.0、18.0 ng/mL）混合溶液进行竞争抑制实验，图1a为同时检测磺胺类和喹诺酮类蛋白芯片竞争抑制的扫描图。采用Origin软件对信号值与质量浓度对数（lgC）作竞争抑制曲线，如图1b所示，磺胺类药物的标准曲线线性范围为0.3～7.2 ng/mL，喹诺酮类药物的标准曲线线性范围为0.4～18 ng/mL。

图1 同时检测磺胺类和喹诺酮类蛋白芯片竞争抑制扫描（a）和竞争抑制标准曲线（bb）Fig.1 Protein chip scanning images (a) and standard curves of competitive inhibition for simultaneous detection of sulfonamides and quinolones (b)

2.7 牛乳加标回收实验结果

表6 磺胺类和喹诺酮类的加标回收率Table 6 Recoveries of sulfonamides and quinolones spiked into blank milk

在优化的实验条件下，精确量取1 mL空白牛乳样本，分别添加磺胺嘧啶（0.50、2.00、5.00 ng/mL）和恩诺沙星（0.50、3.00、15.00 ng/mL）的对照品，每个样本测3 次。按照1.3.3节的方法处理后，质量浓度范围内添加，磺胺类的回收率在85%～110%之间，喹诺酮类的回收率在83%～98%之间，CV均在10%以内，可以满足磺胺类和喹诺酮类残留限量的要求（表6）。

3 结 论

本实验实现了可视化蛋白芯片法同时检测牛乳中磺胺类和喹诺酮类药物的多残留，该方法具有测定时间短、灵敏度高及操作简单等优点。养殖过程中多种兽药同时或交替使用而造成的药物多残留对检测提出了很大挑战，因而开发能提高检测效率、降低检测的成本和避免漏检的药物多残留分析方法具有重要意义，对于安全开发能同时检测多种药物残留[24-25]的快速灵敏的方法更具有实际意义。

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Simultaneous Determination of Multiresidues of Sulfonamides and Quinolones in Milk with Visual Protein Chip

ZHONG Wenying1, WANG Xingru1, XU Danke2,*, LI Zhonghui2, LI Zhoumin2
(1. Department of Analytical Chemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China; 2. State Key Laboratory of Analytical Chemistry for Life Science, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University, Nanjing 210093, China)

Purpose: To develop a protein microarray method for the simultaneous detection of multiresidues of two veterinary drugs, sulfonamides and quinolones, in milk with a visual protein chip. Methods: A 96-well microplate was used as solid support, on which artificial antigens of sulfonamides and quinolones were immobilized, respectively. After immobilization, a mixture of antibodies to two analytes and either standard solutions containing the analytes or samples were added to the array reaction area. Silver nanoparticles (AgNPs)-labeled goat anti-mouse IgG were used as an indicator and nanosilver enhancement technique was applied to amplify the detection signals, producing black image on array spots visible with naked eyes. The signals were detected with a visual scanner; therefore the analyte residues could detected quantitatively. Results: The linear ranges for sulfonamides and quinolones were 0.3–7.2 ng/mL and 0.4–18 ng/mL respectively. The recovery rates were in the range of 83% to 110% for milk samples at spiked levels of 0.5/0.5, 2.0/3.0, and 5.0/15.0 ng/mL with coefficient of variation (CV) values ＜ 10%. Conclusions: These results indicate that the protein microarray method is suitable for the routine screening of multiresidues of sulfonamides and quinolones in milk.

protein chip; indirect competition; multiresidue detection; sulfonamides; quinolones

10.7506/spkx1002-6630-201602034

O657

A

1002-6630（2016）02-0193-05

钟文英, 王兴如, 许丹科, 等. 可视化蛋白芯片法同时检测牛乳中残留的磺胺类和喹诺酮类药物[J]. 食品科学, 2016, 37(2): 193-197. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602034. http://www.spkx.net.cn

ZHONG Wenying, WANG Xingru, XU Danke, et al. Simultaneous determination of multiresidues of sulfonamides and quinolones in milk with visual protein chip[J]. Food Science, 2016, 37(2): 193-197. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602034. http://www.spkx.net.cn

2015-03-16

江苏研究生科研创新计划项目（KYZZ-0184）

钟文英（1968—），女，教授，博士，研究方向为仪器分析。E-mail：wyzhong@cpu.edu.cn

*通信作者：许丹科（1965—），男，教授，博士，研究方向为生物芯片。E-mail：xudanke@nju.edu.cn