中国泡菜乳杆菌种质资源调查

代富英，戴雨珂，王海娟，苏森森，杜昕，潘渠，*

（1.成都医学院病原生物学教研室，四川成都610500；2.成都医学院公共卫生系，四川成都610500）

中国泡菜乳杆菌种质资源调查

代富英1，戴雨珂2，王海娟1，苏森森1，杜昕1，潘渠1，*

（1.成都医学院病原生物学教研室，四川成都610500；2.成都医学院公共卫生系，四川成都610500）

为了进一步探索中国泡菜中乳杆菌种质资源，使用自主研发的乳杆菌快速检出方法和16sRNA基因测序鉴定技术，对采自14个省级行政区的81份泡菜样品进行了检测。乳杆菌分离率为45.7％，证明中国泡菜中有丰富的乳杆菌种质资源。共分离到7种44株乳杆菌。其中植物乳杆菌菌株占分离乳杆菌菌株总数的79.5％，表明泡菜中乳杆菌的种类以植物乳杆菌为主。在重庆分离到了2012年在台湾发现的福菜乳杆菌，再次证明了该菌种在自然界中的存在。中国泡菜中的乳杆菌种质资源存在地区差异，乳杆菌分离率较突出的地区分别是云南（200％），重庆（125％），江苏（133％）和东北（100％）。湖南泡菜中可能较为缺乏乳杆菌种质资源。

中国泡菜；乳杆菌；16sRNA；益生菌；种质资源

乳杆菌（Lactobacillus）是一种公认安全无害的微生物，其特征为革兰染色阳性、无芽胞，能够分解糖分产生乳酸的一类杆菌。乳杆菌广泛存在于各类发酵食品中，目前已经从乳制品及泡菜等碳源丰富环境中分离出一百多种乳杆菌［1］。目前的研究表明乳杆菌有明确的益生作用，市场上已经开发出多种乳杆菌制剂用于维持胃肠道健康和胃肠道疾病治疗。进一步的研究表明，乳杆菌的益生作用可能通过脑肠轴传递到大脑，可以使人保持良好的情绪，有可能将乳杆菌开发为治疗自闭症、焦虑症和抑郁症等精神心理性疾病的药物［2-3］。

中国制作泡菜的传统由来已久，在川渝等地尤为明显。我们前期的工作表明泡菜中有丰富的乳杆菌资源［4］，可能有乳杆菌新种有待于我们去发现。从周边喜爱制作泡菜的国家的研究来看，我们也有理由预期中国泡菜中有新的乳杆菌，比如韩国，在泡菜中发现了5个乳杆菌新种，分别命名为：Lactobacillus koreensis、Lactobacillus yonginensis［5］、Lactobacillus ginsenosidimutans［6］、Lactobacillus kimchicus和Lactobacillus kimchii；日本在泡菜中发现了6个乳杆菌新种和亚种，分别命名为：Lactobacillussenmaizukei、Lactobacillusdelbrueckii subsp.Sunkii［7］、Lactobacillus kisonensis、Lactobacillus otakiensis、Lactobacillus rapi和Lactobacillussunkii。

为了进一步探索中国泡菜中乳杆菌种质资源，我们使用自主研发的乳杆菌快速检出方法，对81份泡菜样品进行了检测。

1　材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

乳杆菌PCR快速检出技术中的引物序列和克隆细菌16s RNA基因的通用引物序列由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成；小量质粒提取试剂盒购自美国omega公司；DNA连接试剂盒购自Promega公司；exTaq酶、TVector pMD 19试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；其它化学试剂购自上海生物工程公司。

Veriti型PCR仪：ABI公司；GenePulser X cellTM型电转化仪、UniversalHood II型凝胶电泳成像仪：美国BIO-RAD公司；1389型超净工作台、LEGENDMicro17型高速离心机：Thermo公司；mLINE型移液器：芬兰Biohit公司。

1.2采样与分离培养

在四川省采样50份，在外省采样31份，共采集泡菜样品81份，泡菜样品采集地列表见表1。

表1　泡菜样品采集地列表Table1 The placesof collection of pickle samples

将泡菜样品中的液体成分使用接种划线的方法接种至MRS培养基上，MRS培养基偏酸性，是适合乳杆菌生长的培养基，可以富集乳杆菌。经过37℃静置培养18 h～48 h后，培养基上长出菌落，初步肉眼判断不同的菌落，每个样品分别挑出3个菌落继续划线分离2次，分离纯化泡菜样品中的细菌。最后每份泡菜只取3个菌落进行鉴定。

MRS培养基配方：蛋白胨10 g、牛肉粉5 g、葡萄糖20 g、吐温80 1mL、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、酵母粉4 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、柠檬酸二铵2 g、去离子水1 L、115℃高温灭菌20min［8］。

1.3革兰染色初步鉴定

革兰染色为阳性，菌体为杆状，观察不到芽胞的菌株进入下一步鉴定。随乳杆菌菌种不同其杆状长短有别，短杆状与球状极易混淆。当实验菌株的菌体不呈典型球状时，均认为是短杆状。

1.4PCR检出

对已通过革兰染色初步鉴定的菌株使用乳杆菌PCR快速检出技术（专利号：ZL201110205040.6）［9］，检出其中的乳杆菌菌株，为避免漏检，对首次检测为阴性的菌株复检一次。

1.5测序鉴定

PCR扩增乳杆菌菌株16s RNA基因［4］，克隆后送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。根据16sRNA基因序列，将乳杆菌菌株鉴定到种。

2　结果与讨论

2.1革兰染色结果

通过MRS培养基上的划线分离和革兰染色鉴定，从81份泡菜样品分离了94株菌株。其中有65株革兰阳性无芽胞杆菌菌株，6株革兰阳性有芽胞杆菌菌株，15株革兰阳性无芽胞球菌菌株，7株酵母菌菌株，1株革兰阴性杆菌菌株。65株革兰阳性无芽胞杆菌菌株进入下一步鉴定。

分离到的革兰阳性无芽胞杆菌大多数为较粗较长的杆菌，少数为短杆型。在MRS培养基上，这些革兰阳性无芽胞杆菌均长出乳白色的圆形、突出、光滑的小菌落。

2.2PCR检出和16sRNA基因测序结果

利用乳杆菌PCR快速检出技术，对革兰染色鉴定为革兰阳性无芽胞杆菌的65菌株进行鉴定，初步检出乳杆菌数目为55株。再通过16s RNA基因全长测序鉴定后，上述55株乳杆菌菌株除4株被鉴定为魏斯氏菌外，其余51株均吻合已有的乳杆菌16sRNA基因序列特征，其中有7株菌株的16sRNA基因序列100％相同，并来自同一泡菜样品，应算作同一菌株，因此此次共分离乳杆菌菌株44株，81份泡菜样品中分离的乳杆菌种类和数量表见表2（魏斯氏菌是革兰阳性的短杆菌，是乳杆菌属近缘菌属，我们的乳杆菌PCR快速检出技术无法区别）。

表2　81份泡菜样品中分离的乳杆菌种类和数量表Table2 The speciesand amountof Lactobacillussp.isolated from Chinesepicklesam ples

本次调查的81份泡菜样品中有37份样品分离到乳杆菌，乳杆菌分离率为45.7％。相比上一次初步调查（36.5％），乳杆菌分离率有所上升。两次调查都证明泡菜中富含乳杆菌种质资源。分离的44株乳杆菌菌株分别属于7个种，分别是植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、清酒乳杆菌（Lactobacillussakei）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、食品乳杆菌（Lactobacillusalimentarius）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、福菜乳杆菌（Lactobacillus futsaii）和弯曲乳杆菌（Lactobacilluscurvatus）（表2）。分离的44株乳杆菌菌株中有35株是植物乳杆菌菌株，占分离乳杆菌菌株总数的79.5％。该结果表明泡菜中乳杆菌的种类以植物乳杆菌为主，符合植物乳杆菌与植物伴生的特点。福菜乳杆菌是2012年在我国台湾地区首次发现的乳杆菌新种［10］，本次调查，我们在重庆分离到了3株福菜乳杆菌，再次证明了该菌种在自然界中的存在，并将其分布从台湾扩展到了重庆。

2.3分离乳杆菌菌株在中国的分布

中国共34个省级行政区，我们从传统上喜爱制作泡菜的地区采集泡菜样品，在14个省级行政区采取了81份泡菜样品。8个行政区分离出了乳杆菌，分别是：四川19株，云南10株，重庆5株，江苏4株，贵州1株，北京3株，辽宁1株，吉林1株。

中国泡菜分南北两系，南方以四川泡菜为代表，流行于云贵川渝四地，北方以东三省的朝鲜族辣白菜为代表。川渝两地为南派泡菜发源地，我们在这两个地区密集采样，采集了54份泡菜样品，分离出3种24株乳杆菌，占总分离乳杆菌株数的54.5％。在四川分离的乳杆菌最多。在北派泡菜发源地东北地区仅采集了2份泡菜样品，其乳杆菌分离率达到了100％。乳杆菌分离率较突出的地区还有3个，分别是云南（200％），重庆（125％）和江苏（133％）。在湖南采样6份，都没有分离到乳杆菌菌株，分离到的是4株魏斯氏菌菌株。魏斯氏菌也是乳酸菌，能像乳杆菌一样发酵糖类产生乳酸。可能湖南泡菜的酸化过程主要是魏斯氏菌在起作用，湖南泡菜中可能较为缺乏乳杆菌种质资源。

分离的7种乳杆菌菌种的分布情况为：云南4种，重庆3种，江苏2种，四川1种，贵州1种，北京1种，辽宁1种，吉林1种。较为突出的是云南和重庆，可以肯定两地的泡菜中存在丰富的乳杆菌种质资源。四川虽然分离到了最多的乳杆菌菌株，但都是植物乳杆菌，表明四川的泡菜中乳杆菌的含量虽然丰富，但种类可能比较单一。

已有的文献都表明四川与云南地区乳杆菌种质资源丰富［11］。我们的研究进一步证实了该结论。北派泡菜中乳杆菌研究起步较晚，但取得了很好的成果，发现了5种新的乳杆菌：牡丹江乳杆菌（Lactobacillusmudanjiangensis）、松花江乳杆菌（Lactobacillus songhuajiangensis）、嫩江乳杆菌（Lactobacillus nenjiangensis）、黑龙江乳杆菌（Lactobacillus heilongjiangensis）和香坊乳杆菌（Lactobacillusxiangfangensis）［12-14］。

3　结论

我们的研究表明，中国泡菜中存在丰富的乳杆菌种质资源，其种类以植物乳杆菌为主，分布上存在地区差异。湖南泡菜中可能较为缺乏乳杆菌种质资源。云南和重庆地区的泡菜中有丰富的乳杆菌种质资源，进一步的调查可能发现乳杆菌新种。乳杆菌是益生菌，是一种宝贵的资源，对中国传统发酵食品中蕴含的乳杆菌种质资源有进一步发掘的必要。

［1］Endo A，Irisawa T，Futagawa-Endo Y，etal.Lactobacillus faecis sp. nov.，isolated from animal faeces［J］.Int JSystEvolMicrobiol，2013，63（12）：4502-4507

［2］Bravo JA，Forsythe P，Chew M V，etal.Ingestion of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA receptor expression in amouse via the vagusnerve［J］.Proc Natl Acad SciUSA，2011，108（38）：16050-16055

［3］Sharon G，Hyde ER，McCue T，etal.Microbiotamodulatebehavioral and physiologicalabnormalitiesassociated with neurodevelopmental disorders［J］.Cell，2013，155（7）：1451-1463

［4］杨四佳，王颖，李宇婷，等.泡菜中乳杆菌的快速检出和乳杆菌质粒资源的初步调查［J］.食品与生物技术学报，2013，32（6）：639-644

［5］YiE J，Yang JE，Lee JM，etal.Lactobacillusyonginensissp.nov.，a lactic acid bacterium with ginsenoside converting activity isolated from Kimchi［J］.Int JSystEvolMicrobiol，2013，63（9）：3274-3279

［6］Jung HM，Liu QM，Kim JK，etal.Lactobacillusginsenosidimutans sp.nov.，isolated from kimchiwith the ability to transform ginsenosides［J］.Antonie Van Leeuwenhoek，2013，103（4）：867-876

［7］Kudo Y，Oki K，Watanabe K.Lactobacillus delbrueckii subsp. sunkiisubsp.nov.，isolated from sunki，a traditional Japanese pickle［J］.Int JSystEvolMicrobiol，2012，62（11）：2643-2649

［8］潘渠，丛延广，侯瑞，等.嗜酸乳杆菌3-磷酸甘油醛脱氢酶的分离纯化［J］.免疫学杂志，2009，25（4）：461-464

［9］潘渠，杨维华，王颖，等.设计乳杆菌特异性引物并运用菌落PCR技术快速检出和鉴定四川泡菜中的乳杆菌［J］.微生物学通报，2011，38（8）：1300-1305

［10］Chao SH，Kudo Y，TsaiYC，etal.Lactobacillus futsaiisp.nov.，isolated from fu-tsai and suan-tsai，traditional Taiwanese fermented mustard products［J］.Int JSystEvolMicrobiol，2012，62（3）：489-494

［11］周光燕，宋萍，王柱，等.西南菌种站乳酸菌菌种资源的收集整理及性能分析［J］.食品与发酵科技，2012，48（4）：15-19

［12］Gu C T，LiCY，Yang L J，et al.Lactobacillusmudanjiangensis sp. nov.，Lactobacillus songhuajiangensis sp.nov.and Lactobacillus nenjiangensis sp.nov.，isolated from Chinese traditional pickle and sourdough［J］.Int JSystEvolMicrobiol，2013，63（12）：4698-4706

［13］Gu C T，LiCY，Yang L J，etal.Lactobacillus heilongjiangensis sp. nov.，isolated from Chinese pickle［J］.Int JSystEvolMicrobiol，2013，63（11）：4094-4099

［14］Gu CT，Wang F，LiCY，etal.Lactobacillus xiangfangensis sp.nov.，isolated from Chinese pickle［J］.Int JSyst EvolMicrobiol，2012，62（4）：860-863

Investigation on Lactobacillus Germp lasm Resources of Chinese Pickle

DAI Fu-ying1，DAI Yu-ke2，WANG Hai-juan1，SU Sen-sen1，DU Xin1，PAN Qu1，*
（1.Department of Pathogenic Biology，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，Sichuan，China；2.Department of Public Health，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，Sichuan，China）

For investigation on Lactobacillus germplasm resources of Chinese pickle，81 samples of Chinese pickle from 14 provinces were collected，and Lactobacillus strains from these samples were isolated using 16 s RNA gene sequencing and rapid-detection PCR technology for Lactobacillus which was designed by our selves.The isolating rate of Lactobacillus strains was 45.7％，which showed there had rich Lactobacillus germplasm resources in Chinese pickle.7 Lactobacillus sp.and 44 Lactobacillus strainswere detected.79.5％ of isolated Lactobacillus strainswere Lactobacillusplantarum strainswhich indicated the dominance Lactobacil－lussp.in Chinese picklewas Lactobacillusplantarum.3 Lactobacillus futsaii strainswere isolated in Chongqing，whichwas first found atTaiwan in 2012.Thereare regionaldifferences in thegermplasm resourcesof Lactobacillus in Chinese pickle.The isolation rate of Lactobacillus strains ismore prominent in Yunnan（200％），Chongqing（125％），Jiangsu（133％）and Northeast region（100％）.Hunan pickles may be lack of Lactobacillus germplasm resources.

Chinesepickle；Lactobacillus；16sRNA；probiotic；germplasm resources

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.038

国家自然科学基金（31170007）；四川省教育厅科技基金重点项目（14ZA0219）；成都医学院病原生物学学科建设项目（CYXK2012005）；成都医学院科研基金项目（CYZ13-019）

代富英（1978—），女（汉），讲师，硕士，医学微生物学专业。

潘渠（1973—），男（汉），副教授，博士，主要从事益生菌研究。

2015-11-04