水杉叶中抗氧化活性物质提取工艺研究

王新，郑萍，马小媛，高红旗，董安荣，蒋彩云，*

（1.江苏经贸职业技术学院工程技术学院江苏省食品安全工程技术研发中心，江苏南京211168；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122；3.上海清轩生物科技有限公司，上海201612）

水杉叶中抗氧化活性物质提取工艺研究

王新1，郑萍1，马小媛2，高红旗3，董安荣1，蒋彩云1，*

（1.江苏经贸职业技术学院工程技术学院江苏省食品安全工程技术研发中心，江苏南京211168；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122；3.上海清轩生物科技有限公司，上海201612）

主要研究水杉叶中抗氧化物质提取工艺，通过单因素试验和正交试验确定最佳的提取工艺为：超声提取，提取溶剂为75％的乙醇，提取温度60℃，料液比为1∶28（g/mL），提取时间1.5 h。该条件很好的保护了水杉提取物的多种生物活性，为合理开发和利用水杉资源打下了良好的基础。

水杉；抗氧化；超声辅助提取；DPPH·

水杉是一种古老的孑遗单种属植物，素有“活化石”之称。《中国中药资源志要》有过这样的记载，水杉叶、果实有清热解毒、消炎止痛的功效，能用于痈疮肿痛、癣疮等症状［1-2］。现代药理研究表明水杉中的化学成分具有抗心脑血管疾病作用、抗菌作用和抗肿瘤作用等。水杉落叶中的化学成分比较复杂，各自的功能也不同，现在已分离出主要成分为黄酮类，萜类（蒎烯、柠檬烯等），糖类，木质素类等［3-4］。本文通过单因素试验和正交试验，研究水杉叶中抗氧化物质的提取工艺。从水杉中提取、精制而得到的产品对人体的多种疾病往往具有很好的治疗、预防等药理作用和保健功能。提取的抗氧化活性物质已用于保健品、食品和药品等领域。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

水杉叶粉末：上海清轩生物科技有限公司；无水乙醇：深圳市华昌化工有限公司；正丁醇：佛山市恒荣化工有限公司；1，3-丁二醇：广州胜欣化工科技有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）：启东亚太化工厂有限公司；抗坏血酸（VC）：斯百全化学（上海）有限公司，都为分析纯，试验用水为去离子纯净水。

1.2仪器与设备

FW100万能高速粉碎机：苏州江东精密仪器有限公司；DGF 30/23-mA电热恒温鼓风干燥箱：苏州银邦节能电热设备有限公司；FA2104N电子分析天平：上海平轩科学仪器有限公司；KQ-100E超声波清洗器：昆山市超声波有限公司；SZCL数显智能控温磁力搅拌器：上海越众仪器设备有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；UV-1801紫外分光光度计：让奇（上海）科技科技有限公司。

1.3方法

1.3.1DPPH·法评价水杉叶提取液的抗氧化性

1.3.1.1DPPH溶液的配制

精确称取39 mg DPPH，用无水乙醇溶解定容到250 mL容量瓶中，得到的DPPH溶液的浓度为0.4mmol/L，将配制好的DPPH溶液移至棕色试剂瓶中置于暗处储存备用。

1.3.1.2DPPH·清除率的计算

本试验采用二苯基苦基苯肼（简称DPPH）分光光度法评价水杉叶中提取物的抗氧化活性，此方法是评价自由基清除效果、挑选天然抗氧化剂最常用的方法［5］。

DPPH·是一种稳定的脂性自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm处有较大吸收峰。在有自由基清除剂存在时，DPPH·的孤对电子被配对，从而使其褪色，在517 nm处的吸收峰会相对减弱，褪色程度与其接受电子呈定量关系。通过紫外可见分光光度计检测DPPH·与样液反应后的吸光度值的变化，从而建立样品清除自由基的能力的评价体系，进行单因素试验和正交试验。具体操作步骤如下：

精密量取2mL提取液和2mLDPPH溶液到比色管，即为反应溶液，将震荡摇匀后的反应溶液置于暗处避光反应30min后，于517 nm波长处测定吸光度值（Abs）得到A反应溶液；精密量取2mL提取液和2mL无水乙醇溶剂到比色管，即为空白溶液，将震荡摇匀后的空白溶液置于暗处避光反应30min后，于517 nm波长处测定吸光度值（Abs）得到A空白溶液；液精密量取提取溶剂2mL和2mLDPPH溶液到比色管，即为空样溶液，将震荡摇匀后的空样溶液置于暗处避光反应30min后，于517 nm波长处测定吸光度值（Abs）得到A空样溶液。

DPPH·清除率/％＝［1-（A反应溶液-A空白溶液）/A空样溶液］×100

1.3.2水杉叶中活性成分的提取

将烘干至恒重的水杉叶样品用粉碎机粉碎后，称取1.0 g水杉叶粉末分别放入相应的提取剂中，在不同的设置条件下进行提取，得到含水杉活性成分的提取溶液。

1.3.3水杉叶总抗氧化能力的测定

1.3.3.1VC标准溶液的配制

用纯净水作为溶剂配制VC溶液，浓度为0.02mg/mL。采用逐级稀释的方法，得到浓度梯度分别为0.004、0.008、0.010、0.012、0.014、0.016mg/mL的VC标准溶液。

1.3.3.2VC标准曲线的制作

将提取液换成不同浓度的VC标准溶液，按照1.3.3.1中的流程进行操作，与517 nm波长下测定相应的吸光度值，得出对应的DPPH·清除率。

1.3.3.3总抗氧化能力的测定

根据最佳工艺提取水杉叶粉末，吸取提取液0.5mL稀释定容到100mL容量瓶中，测定对DPPH溶液的清除率，再根据VC与DPPH·的线性方程计算出每克水杉叶样品抗氧化成分相当于含有VC的量。

2　结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1不同提取剂对水杉叶中抗氧化物提取效果的影响

称1.0 g水杉叶粉末于30mL溶剂中，溶剂分别采用纯水、无水乙醇、75％乙醇、50％乙醇、1，3-丁二醇、正丁醇在40℃下超声0.5 h，抽滤之后得到样品的提取液。得到的提取液进行稀释后，与DPPH·在暗处反应30min（下同），测得的试验结果如图1所示。

图1　不同提取溶剂提取抗氧化物效果Fig.1 Antioxidanteffectof extraction of differentextraction solvents

从图1中可以看出75％的乙醇提取效果最好，无水乙醇提取效果次之，而纯水提取效果最差。这是由于黄酮类、萜类等的活性物质一般都是易溶于乙醇、甲醇等的有机溶剂，不溶于水，因此，水杉叶中抗氧化物提取的最佳提取溶剂为乙醇。

2.1.2乙醇不同浓度对水杉叶中抗氧化物提取效果的影响

称1.0g水杉于30mL溶剂中，溶剂分别采用60％、70％、75％、80％、90％的浓度，在40℃下超声0.5 h，抽滤之后得到样品的提取液，测得的试验结果如图2所示。

图2　乙醇不同浓度提取抗氧化物效果Fig.2 Antioxidanteffectof different concentrationsof ethanol extract

从图2中可以看出75％的乙醇提取效果最好，70％的乙醇提取效果次之，而90％的提取效果最差。这与高鹏、牟新利等人做的研究结论是相符的［6］，在他们的研究中提到：用95％乙醇只能将黄酮甙元提取完全，黄酮甙的提取效率低，成本高，50％乙醇提取率较低，用75％的乙醇既可以提取出黄酮甙元也能提取出黄酮甙，成本适中，提取率也有保证，安全无毒，操作方便，适合工业化生产，因此，本文中水杉叶抗氧化物提取的乙醇最佳提取浓度是75％。

2.1.3不同提取方式对水杉叶中抗氧化物提取效果的影响

称1.0 g水杉叶粉末加入到30mL的75％乙醇中，在40℃下分别采用超声波辅助、水浴振荡、静置、磁力搅拌4种提取方式进行提取，提取时间为0.5 h，得出的结论如图3。

图3　不同提取方法提取抗氧化物效果Fig.3 Antioxidanteffectof thedifferentextractionmethods

从图3中可以看出，超声波提取水杉中抗氧化物效果最好，水浴振荡效果次之，而静置的效果最差。同传统的提取方法相比，超声波提取具有保护药物活性成分、提取能力强等优点［7］。因此，水杉叶中活性物质提取的最佳提取方法是超声波提取。

2.1.4料液比对水杉中抗氧化物提取效果的影响

称1.0 g水杉粉末加入不同体积的75％乙醇，提取温度为40℃，超声提取时间0.5 h的条件下，依次在料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）的条件下进行提取，如图4所示。

图4　不同料液比提取抗氧化物效果Fig.4 Antioxidanteffectof different liquid ratio extraction

料液比1∶25（g/mL）效果最好，1∶30（g/mL）效果次之，而1∶10（g/mL）效果最差。料液比低的时候，原料并没有提取完全，所以总的抗氧化能力比较低；而料液比比较大的时候，不仅浪费提取溶剂，而且浪费能源、热能等。因此，水杉叶中抗氧化物提取的最佳料液比是1∶25（g/mL）。

2.1.5不同提取时间对水杉叶中抗氧化物提取效果的影响

称1.0 g水杉叶粉在25mL 75％乙醇溶液中，温度为40℃的条件下，依次在0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h的时间下进行超声提取，测定其抗氧化能力，所得的抗氧化效果如图5所示。

图5　不同提取时间提取抗氧化物效果Fig.5 Antioxidanteffectof extraction of differentextraction time

由图5可以看出，提取时间0.5 h的提取效果最好，5 h效果最差。时间越短对活性物质提取效果越好，时间越长破坏水杉成分，如叶绿素等的。因此，水杉叶中抗氧化物提取的最佳提取时间为0.5 h。

2.1.6不同提取温度对水杉叶中抗氧化物提取效果的影响

称水杉叶粉1.0 g于25mL提取液浓度为75％的乙醇溶液，提取时间为0.5 h条件下，依次在温度为40、50、60、70、80℃下进行提取，其结果如图6所示。

图6　不同提取温度提取抗氧化物效果Fig.6 Antioxidanteffectof extraction of differentextraction tem perature

由图6可知，60℃提取效果最好，80℃效果最差。这是由于温度升高，有利于样品中的黄酮类化合物扩散到溶剂中，温度高于60℃，超过乙醇的沸点，大部分乙醇以气态存在，溶剂总量减少，所以提取率反而降低［8］。因此，水杉叶中抗氧化物提取的最佳提取温度为60℃。

2.2正交试验

根据单因素试验结果，选取影响水杉叶中抗氧化物质提取效果主要因素，每个因素选取3个水平，所选取的各水平见表1，正交试验结果见表2。

表1　正交试验因素水平设计Table1 Factorsand levelsof orthogonal test design

表2　L9（34）正交试验结果Table2 The resultsof L9（34）orthogonal test

续表2 L9（34）正交试验结果Continue table2 The resultsof L9（34）orthogonal test

根据正交试验中的最佳提取条件，称1.0 g取3份水杉叶粉末样品，分别加入28mL的75％乙醇，并在温度为60℃下，超声辅助提取1.5 h得到提取液，分别测定水杉提取物对清除DPPH·的结果为：68.3％；69.2％；66.9％，即平均抗氧化效果为：68.1％。

2.3水杉叶总抗氧化能力的测定

利用DPPH·分光度法分别测定已知标准浓度的VC的抗氧化性，以DPPH·清除率为纵坐标，VC浓度为横坐标，建立相对应的标准曲线。DPPH·在不同浓度的VC标准液下光谱图的变化见图7。

图7　DPPH·溶液在不同VC浓度下的吸收光谱图Fig.7 Theabsorption spectra of DPPH·solution at different VCconcentrations

由图7可知，随着VC浓度的不断增加，对DPPH·的清除能力也随之加强，在517 nm处吸收峰的强度降低。

VC溶液浓度与DPPH·清除率的标准曲线见图8。

从图8中可知，VC（x）浓度和DPPH·清除率（y）之间符合线性关系，其线性方程为y=4 496.07x-1.896（R=0.999 1）。

以VC作为标准参照物，采用DPPH·分光光度法建立了VC抗氧化性的评价体系，并利用此体系作为水杉叶提取物总抗氧化能力的测定依据，进而计算出每克水杉叶样品中抗氧化活性成分含有的VC当量。

称取1.0 g的水杉样品，加入28mL 75％乙醇，在最佳温度60℃和时间1.5 h条件下提取得到提取液，测定提取液对DPPH·的清除率，由VC溶液与DPPH·溶液的标准曲线方程：y=4 496.07x-1.896（R=0.999 1），计算出每克水杉样品中抗氧化成分相当于VC的含量为：63.2mg。

图8　VC溶液浓度与DPPH·清除率的标准曲线Fig.8 The standard curveof the concentration of VCand DPPH· removal rate

3　结论

通过超声提取法对水杉叶中的抗氧化活性物质进行了提取，通过单因素试验和正交试验，考查了不同因素如提取剂浓度、提取温度、提取时间、料液比等对水杉叶抗氧化成分提取效果的影响，其影响主次为：提取温度＞料液比＞提取溶剂＞提取时间。确定了水杉叶中的抗氧化活性物质的最佳提取工艺条件为：提取溶剂为75％的乙醇，提取温度60℃，料液比为1∶28（g/mL），提取时间1.5 h。

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Study on the Extraction Technology of the Antioxidant Com ponents from M etasequoia Leaves

WANG Xin1，ZHENG Ping1，MA Xiao-yuan2，GAO Hong-qi3，DONG An-rong1，JIANG Cai-yun1，*
（1．Jiangsu Engineering and Research Center of Food Safety，Departments of Engineering and Technology，Jiangsu Institute ofCommerce，Nanjing 211168，Jiangsu，China；2.Schoolof Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China；3．ShanghaiQingxuan Biological Technology Co.，Ltd.，Shanghai 201612，China）

Extraction process of the antioxidant components from metasequoia leavesare studied in this paper. Thebestextractconditionswere identified by single factor testand orthogonal test.Theextractmethod，solvent，the temperature，the ratio ofsolvent to rosemary and the timewere ultrasonic extraction，75％ethanol，60℃，1∶28（g/mL）and 1.5 h respectively.The condition is very good to protecta variety ofbiologicalactivity of the extracts frommetasequoia，rationaldevelopmentand utilization ofmetasequoia resourceshave laid a good foundation.

metasequoia；antioxidant；ultrasonicassistedextraction；DPPH·

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.009

国家自然科学基金青年基金（31401665）；江苏省高校青蓝工程（QL2012006）；江苏省高等职业院校高级访问工程师计划（2014FG033）；江苏经贸职业技术学院重大研究课题资助项目（JSJM15005）

王新（1982—），女（满），讲师，硕士研究生，研究方向：功能食品的开发。

2015-11-05