水陆二仙丹通过增加精液中PMNE抑制剂含量抑制精子氧化损伤的发生

何碧英

（中山市中医院检验科，广东中山528400）

水陆二仙丹通过增加精液中PMNE抑制剂含量抑制精子氧化损伤的发生

何碧英

（中山市中医院检验科，广东中山528400）

目的评价水陆二仙丹对男性不育患者精子氧化损伤的影响，并探讨其可能的作用途径。方法将80例不育患者采用随机双盲平行安慰剂对照的方法分为治疗组和对照组，每组各40例，两组均服用抗氧化剂，在此基础上，治疗组服用水陆二仙丹水煎剂，对照组服用安慰剂，疗程为3个月。同时收集20例健康捐精者的精液作为正常对照组。对精子基本参数（精子密度、精子活动率及正常精子形态）的变化及精液中超氧化歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）及α1抗胰蛋白酶的水平进行比较。结果①治疗前，治疗组和对照组的精子密度、精子活动率及正常精子形态均低于正常对照组（P＜0.05）。治疗后，治疗组和对照组的精子基本参数（精子密度、精子活动率及正常精子形态）均显著改善（P＜0.0001），且治疗组改善精子基本参数的程度显著高于对照组（P＜0.0001）。②治疗前，治疗组和对照组NE及MDA的水平均明显高于正常对照组，而α1抗胰蛋白酶和SOD水平均低于正常对照组（P＜0.05）。治疗后，治疗组和对照组NE和MDA的水平较治疗前均显著降低（P＜0.0001），而α1抗胰蛋白酶及SOD的水平则显著升高（P＜0.0001），且治疗后治疗组α1抗胰蛋白酶水平在显著高于对照组（P＜0.0001），MDA的水平显著低于对照组（P＜0.0001）。相关性的分析结果显示，MDA水平与NE的水平呈明显正相关（r=0.9863，P=0.0003），MDA水平与α1抗胰蛋白酶呈显著负相关（r=-0.9670，P=0.0016）。结论水陆二仙丹可能通过增加精液中NE抑制剂（α1抗胰蛋白酶）含量抑制精子氧化损伤的发生。

水陆二仙丹；α1抗胰蛋白酶；精子；氧化损伤

不育症作为影响人们社会心理及生化的医学临床问题一直以来备受关注［1］，引起男性不育的因素很多，其中生殖道中酶系统的失衡是被认为是造成男性不育的重要原因，如活性氧（reactive oxy-gen species，ROS）产物和抗氧化剂清除剂之间的失衡、中性粒细胞弹性蛋白酶（neurtophil elastase，NE）和其抑制剂的失衡，两者系统的稳定与正常是维持精子发生必不可少的条件［2，3］。正常生理条件下，ROS在维持男性生殖生理功能如细胞信号转导、激素的产生、精子获能、顶体反应以及精子活力等方面发挥着重要作用［4-6］，而中性粒细胞弹性蛋白酶则有益于精液中有害病菌的清除及受损组织的再生愈合［2］。在病理条件下，过量的活性氧及高度活化的NE都会引起精子结构及功能的损伤［7］。水陆二仙丹载于宋代《洪氏集验方》，其由金樱子和芡实两味中药组成，两药配伍，能补肾健脾，具有很好的抗氧化活性［8，9］，男科疾病之阳痿遗精可在辩证的基础上酌加使用［10］。本实验旨在观察水陆二仙丹对不育患者精子质量的影响，并尝试从NE抑制剂（α1抗胰蛋白酶）及抗氧化酶的角度探讨其作用的初步机制。

1 资料及方法

1.1 资料80例男性不育患者来自2012年10月至2014年12月本院泌尿男科，纳入标准：①自愿签署知情同意书；②患者年龄在23～50岁之间，以降低年龄因素对研究因素的影响；③婚后性生活正常但1年以上不育，性功能无障碍，附睾、睾丸、输精管等无异常，无家族性遗传病；④患者未接受过正规的相关治疗，以排除治疗因素对研究因素的影响。排除标准：①无精子症；②未按规定服用药物；③过敏体质或者是对多种药物过敏。同时选择同期我院进行查体健康者20例作为正常对照组，纳入标准：①自愿签署知情同意书捐献精子；②年龄在23～35岁之间，③具有生育能力，④未服用影响精子质量的药物。

1.2 治疗方法80例不育患者均接受服用维生素C、GSH、辅酶Q-10等抗氧化剂的基础治疗，在以上基础上，随机将80例患者分为2组，每组各40例，治疗组给予水陆二仙丹水煎剂（本院中药房煎剂），服用方法为早晚两次，每次150～200ml。对照组给予安慰剂，服法相同，疗程均为3个月。手淫法收集治疗组和对照组治疗前及治疗4周后的精液样本。正常对照组同法收集。

1.3 观察指标在SFA-500精液分析系统上进行精子密度、精子活动率和形态等基本参数的分析；采用紫外分光光度法检测总超氧化歧化酶活力（T-SOD）及丙二醛（MDA）含量（总超氧化歧化酶及丙二醛测定试剂盒购于研域化学试剂有限公司，操作按试剂盒）；采用ELISA法检测中性粒细胞弹性蛋白酶及α1抗胰蛋白酶的浓度（精浆弹性蛋白酶定量检试剂盒购于上海胜隆实业有限公司，α1抗胰蛋白酶试剂盒购于上海优宁维有限公司，操作按试剂盒）。

1.4 统计方法在统计软件SPSS 13.0进行数据的处理，各测量指标用均值±标准差（x±s）表示，各组数据间的比较采用T检验，采用pearson进行相关性分析，以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 精子基本参数的比较治疗前，治疗组和对照组精子密度、精子活动率及正常精子形态均低于正常对照组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。治疗后，两组患者精子的基本参数（精子密度、精子活动率及正常精子形态）较治疗前均明显升高（P＜0.0001），治疗前，两组患者精子的基本参数无明显差异（P＞0.05），但治疗后治疗组改善精子基本参数（精子密度、精子活动率及正常精子形态）的作用显著强于对照组，见表1。

表1 精子基本参数的比较（x±s）

2.2 各组NE、α1抗胰蛋白酶、SOD及MDA水平的比较治疗前，治疗组和对照组NE及MDA的水平均明显高于正常对照组，而α1抗胰蛋白酶和SOD水平均低于正常对照组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。治疗后，治疗组和对照组患者精液中NE及MDA水平与治疗前比较均明显降低（P＜0.0001），而α1抗胰蛋白酶和SOD水平则显著升高（P＜0.0001）。治疗后，治疗组精液中NE及SOD的水平与对照组NE及SOD的水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但治疗后治疗组α1抗胰蛋白酶的水平显著高于治疗后对照组的水平（P＜0.0001），而MDA的水平则明显低于治疗后对照组MDA的水平（P＜0.0001），相关性的分析结果显示，MDA水平与NE的水平呈明显正相关（r=0.9863，P =0.0003），MDA水平与α1抗胰蛋白酶呈显著负相关（r=-0.9670，P=0.0016），见表2。

表2 各组NE、α1抗胰蛋白酶、SOD及MDA水平的比较（x±s）

3 讨论

生殖系统内酶系统的稳态对于精子功能的发挥是必不可少的条件，酶系统的失衡会对生殖能力造成不利的影响。中性粒细胞弹性蛋白酶属于基质金属蛋白酶超家族，来源于中性粒细胞中，在正常生理条件下，中性粒细胞弹性蛋白酶对宿主起保护的作用，其活性受多种蛋白酶抑制剂的调控。α1抗胰蛋白酶是中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂中的一种，其大量存在于精浆中，可与NE形成较强的复合物，进而抑制NE的活性，从而保护精子免受NE的损伤［11，12］。在疾病状态下，中性粒细胞弹性蛋白酶高度活化，这类降解酶的活化与男性前列腺炎症、生殖道的感染息息相关，精液中的中性粒细胞弹性蛋白酶可破坏精液中的有益成分，如免疫球蛋白结合因子、内氨酰氨基肽酶和膜联蛋白I［13-15］。SOD作为细胞内主要的抗氧化酶，超氧阴离子在其作用下能转化为过氧化氢或者氧，反映机体本身清除自由基的能力［16］。在正常生理条件下，自由基的产生与清除处于动态的平衡状态，而一旦ROS水平过高，造成机体内自由基过量，超过机体本身的清除能力时，则会引起脂质过氧化，引起组织、器官或细胞的损伤，目前，MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，其量的高低直接显示了机体受氧化损伤的程度，在生殖系统内，由于ROS水平过高引起的MDA水平过高也会对精子功能的发挥产生不利的影响，进而有可能造成不育［17，18］。

水陆二仙丹由金樱子和芡实由金樱子和芡实两味中药组成，在传统中医药的应用中，其可用于男科疾病之阳痿遗精，而现代药理研究显示，金樱子和芡实均有很好的抗氧化活性，因此，本实验从氧化应激角度求证水陆二仙丹对不育症的作用。结果显示：在80例不育患者中，精液中的SOD水平明显低于正常对照组，而MDA的水平则明显高于正常对照组，提示精子处于氧化应激的状态，经抗氧化剂及水陆二仙丹治疗后，两组SOD水平较治疗前均显著升高，MDA的水平则显著降低，且经水陆二仙丹治疗后的改善程度优于抗氧化剂的治疗，提示水陆二仙丹具有明显的抗氧化活性。现有的报道认为，精液中NE水平的过高会引起ROS的产生，造成生殖系统的氧化损伤［3］，基于这些报道，本实验同时检测了两组患者治疗前后NE及α1抗胰蛋白酶的水平，结果表明：在80例不育患者中，精液中的α1抗胰蛋白酶水平明显低于正常对照组，NE的水平则明显高于对照组，α1抗胰蛋白酶水平相对于NE过低，α1抗胰蛋白酶尽管只是NE抑制剂的一种，但其在精液中大量存在，进而能反映精液中NE抑制剂的水平。经治疗后，治疗组和对照组α1抗胰蛋白酶的水平较治疗前均显著升高，且治疗后治疗组α1抗胰蛋白酶的水平则明显高于对照组，提示增加精液中α1抗胰蛋白酶的水平是水陆二仙丹作用的一个环节。NE的活性受多种蛋白酶抑制剂的调控，并与蛋白酶抑制剂处于动态的平衡状态，而α1抗胰蛋白酶是中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂中的一种，本研究结果表示治疗后NE的水平则显著降低，但治疗后治疗组和对照组NE的水平无明显差别，其中原因可能是NE的活性还受其他强蛋白酶抑制剂的调控。相关性的分析结果显示，MDA水平与NE的水平呈明显正相关，MDA水平与α1抗胰蛋白酶呈显著负相关。同时，精子的基本参数（精子密度、精子活动率及正常精子形态）均得到了显著的改善。以上结果表明，水陆二仙丹可能通过增加精液中NE抑制剂含量抑制精子氧化损伤的发生，改善不育患者精子的质量，为水陆二仙丹应用于不育症的临床治疗奠定了基础。

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Shuilu Erxian pill inhibits sperm oxidative damage via increasing the level of neutrophil elastase inhibitor in semen HE

Biiying.
Department of Laboratory Medicine，Zhongshan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhongshan Guangdong 528400，China.

Objective To evaluate how Shuilu Erxian pill affects sperm oxidative damage in infertile man.Methods 80 patients were randomly divided into two equal groups and all were given antioxidant therapy.On basis of this，patients in treated group were given Shuilu Erxian pill，while patients in control group were given placebo for three months.At the same time，the sperm from 20 healthy donor were considered as normal control group.Sperm characteristics（sperm density sperm motility and normal sperm morphology）and levels of superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），neurtophil elastase as well as α1 antitrypsin were compared.Results①Before treatment，the sperm density，sperm motility and normal sperm morphology in the treatment group and the control group were lower than those in the normal control group（P＜0.05）.After treatment，these sperm characteristics in the treatment group and the control group were markedly improved better（P＜0.0001），which was more obvious in treated group（P＜0.0001）.②Before treatment，levels of NE and MDA in the treatment group and the control group were significantly higher than the normal control group，and levels of α1 antitrypsin and SOD were lower than the normal control group（P＜0.05）.After treatment，the levels of NE and MDA in two groups were significantly decreased（P＜0.0001）while the levels of α1 antitrypsin and SOD were increased（P＜0.0001）.Moreover the level of α1 antitrypsin in treated group was significantly higher than that in control group（P＜0.0001）.And MDA level in treated group was obviously lower than that in control group（P＜0.0001）.Further correlation analysis showed that MDA displayed positive correlation with NE（r=0.9863，P=0.0003）and negative correlation with α1 antitrypsin（r=0.9670，P=0.0016）.Conclusion Shuilu Erxian pill may inhibited sperm oxidative damage via increasing the level of neutrophil elastase inhibitor in semen.

Shuilu Erxian pill；α1 antitrypsin；sperm；oxidative damage

R446.19，R698+.2，R711.6

A

1674-1129（2016）05-0583-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.05.015

2015-09-25；

2016-07-06）

何碧英，男，1982年4月生，主管技师，本科，主要从事临床方向研究。hebiying10h@163.com