Hedgehog通路下游转录因子Gli-1与Snail在肝胆管细胞癌中的表达及其临床意义

章维，张苗尊，李明主，郑必春，顾昕

Hedgehog通路下游转录因子Gli-1与Snail在肝胆管细胞癌中的表达及其临床意义

章维，张苗尊，李明主，郑必春，顾昕

目的观察胶质瘤相关癌基因同源蛋白-1（Gli-1）和锌指转录蛋白（Snail）在肝胆管细胞癌组织中的表达。方法应用免疫组化SP法检测在20例正常肝胆管组织和52例肝胆管细胞癌组织中Gli-1蛋白和Snail蛋白的表达，并进行相关性分析。结果20例肝胆管细胞正常组织Gli-1阳性表达3例（15%），Snail表达4例（20%）；52例肝胆管细胞癌组织中Gli-1阳性表达40例（76.92%），Snail阳性表达37例（71.15%）；癌旁组织分别为19例（36.53%）和17例（32.69%），差异均有统计学意义（均＜0.05）；Gli-1的表达与血管侵犯和淋巴结转移有关（＜0.05），Snail表达与分化程度、血管侵犯及淋巴结转移有关（＜0.05），Gli-1与Snail表达存在正相关性（＜0.05）。结论肝胆管细胞癌组织中Gli-1和Snail高度表达，且与血管侵犯和淋巴结转移相关，表明Hh信号通道和EMT异常可能与肝胆管细胞癌侵袭和转移有关。

癌；肝；胆；Gli-1；Snail；病理

肝胆管细胞癌（IHCC）发生于肝内的胆管，发病隐匿，极易发生转移，其发生、发展涉及多条信号通路，发病机制目前仍不清楚。胶质瘤相关癌基因同源蛋白-1（Gli-1）作为Hedgehog通路中最重要的核转录因子，其与Hedgehog信号通路目的基因的启动子结合，直接调控Hedgehog信号通路目的基因的转录表达。锌指转录蛋白（Snail）是近年发现的锌指转录蛋白，可下调E-cadherin表达，在多种恶性肿瘤中作为一种重要的预后因素。本研究通过测定Hh信号通路下游转录因子Gli-1及Snail的表达情况，并综合患者临床特征，从而探讨Gli-1、Snail与胆管细胞癌发生、发展、侵袭的相关性及其临床意义。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2009年1月至2014年12月宁波大学附属鄞州医院及宁波市第二医院原发性IHCC患者标本52例，所有患者均经病理确诊，另外收集正常肝组织标本20例。52例IHCC标本中，男25例，女27例；年龄36～73岁，平均63.2岁；合并乙型肝炎者15例，乙肝阴性者37例；根据病理学分级，其中中度分化29例，低度分化23例。根据有无门静脉癌栓分为两组（有12例，无40例），根据有无淋巴结转移分为两组（有18例，无34例）。所有患者均未接受术后辅助治疗（如化疗、放疗或其他治疗），并且全部接受同种治疗方案。自手术日起随访1至36个月（平均10.1个月）。

1.2 方法试剂：Gli-1兔多克隆IgG抗体（H-300）购自美国Santa Cruz公司，兔Snail多克隆IgG抗体购自Abcam公司，SP试剂盒在北京中杉金桥生物技术有限公司可以购得，并提供试剂盒和基本操作方法。应用免疫组化SP方法检测Gli-1蛋白和Snail蛋白的表达。供体蜡块常规切片，HE染色阅片后，选取病变典型部位，将52例患者标本按癌组织/癌旁组织的顺序制备成石蜡切片，以20例正常肝组织标本为对照。检测方法按试剂盒操作说明，切片常规脱蜡、水化，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，37℃条件处理10min，经Tris-EDTA抗原修复液中微波抗原修复15min，山羊血清封闭30min，一抗4℃过夜，生物素标记的二抗37℃反应30min，辣根酶标记链酶卵白素37℃反应30min，显微镜下控制DAB染色，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片。

1.3 诊断标准阳性细胞百分率及显色深浅采用半定量积分法分级。评分标准：（1）阳性细胞百分率：未见阳性细胞者为0分；＜25%为1分；25%～75%为2分；＞75%为3分。（2）显色深浅：不显色或显色不清为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。以上2项相加最终评定结果，0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为中度阳性（2+），＞5分为强阳性。

1.4 统计方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，采用Mann-Whitney U检验分析癌组织、癌旁组织、正常肝组织的Gli-1与Snail蛋白的表达水平；采用2检验检测Gli-1与Snail表达与临床资料的关系；相关性分析采用Spearman相关分析。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Gli-1与Snail表达情况20例肝胆管细胞正常组织Gli-1阳性表达3例（15%），Snail阳性表达4例（20%）；52例肝胆管细胞癌组织中Gli-1阳性表达40例（76.92%），Snail阳性表达37例（71.15%），癌旁组织分别为19例（36.53%）和17例（32.69%）；胆管细胞癌组织、癌旁组织和胆管细胞正常组织的Gli-1蛋白阳性表达率和Snail蛋白阳性表达率差异均有统计学意义（均＜0.05）。见表1。

2.2 Gli-1、Snail表达与临床资料

Gli-1的表达与肝胆管细胞癌的性别、年龄、肝硬化及分化程度无关（＞0.05），与血管侵犯和淋巴结转移有相关（＜0.05）；Snail的表达与肝胆管细胞癌的性别、年龄、肝硬化无关（＞0.05），与分化程度、血管侵犯及淋巴结转移有关（＜0.05）。见表2。

2.3 Gli-1与Snail的相关性52例胆管细胞癌中，Gli-1与Snail表达均阴性8例，均阳性33例，Gli-1阳性而Snail阴性7例，Snail表达阳性Gli-1阴性4例，Gli-1与Snail表达存在正相关性（=0.457，＜0.05）。见表3。

3 讨论

Hedgehog基因的发现源于对果蝇胚胎发育的研究，在人类中，该通路的传递过程可以简单总结为Hedgehog-Ptchl-Smo-Gli过程。Gli-l作为Hedgehog通路中最重要的核转录因子，负责调控该通路下游众多效应因子，其与Hedgehog信号通路中下游基因的启动子结合，直接调控Hedgehog信号通路目的基因的转录表达。近年来多项研究表明hedgehog通路在胃肠肿瘤中发生异常活化［1-4］。本研究发现Gli-1在肝胆管细胞癌组织中高表达，并与血管侵犯和淋巴结转移密切相关，这表明Hh信号通路过度表达可能在肝胆管细胞癌血管侵袭和转移中起到重要作用。

上皮-间质转移（EMT）多发生于胚胎细胞发育及肿瘤发生、发展过程中，且在慢性炎症及纤维化疾病中扮演重要角色。EMT的重要特征是细胞间连接的断裂、顶-基底极性转为前后极性，从而获得侵袭和转移能力［5-6］。因此，EMT是肿瘤侵袭和转移的早期指标，而E-cadherin的缺失是EMT的标志，包括锌指蛋白Snail/slug家族，Twist、ZEB1、SIP1、E12/E7等术中转录因子被发现与E-cadherin的转录抑制有关。其中Snail是E-cadherin最重要的转录抑制因子，有研究发现Snail的表达水平与多种肿瘤的转移、复发及不良预后密切相关。Snail的表达在乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、原发性肝细胞肝癌及胃癌中均有上调［4，7-9］。本研究中Snail在肝胆管细胞组织中高表达，并且与肿瘤分化、血管侵犯和淋巴结转移有相关性。

有研究报道表明Hh信号通道与EMT之间有相关性。Ohta等［5］报道弥漫型胃癌组织中Gli-1可刺激SIP1转录，从而激活包括Twist和Snai2等EMT相关转录因子，Hh信号通道和EMT过程在肿瘤侵袭和转移过程有密切联系。Wang等［3］发现胃癌患者中Gli-1、Snail和E-cadherin异常表达与预后不良相关，表明Hh信号通道和EMT可能影响胃癌预后，但通过多因素生存研究发现，Gli-1和Snail并不是预后独立影响因素，考虑肿瘤发生发展可能是多基因多通道的一个过程。本研究结果发现在肝胆管细胞癌中Gli-1和Snail的表达有相关性，且均与血管侵犯和淋巴转移相关。

本研究发现肝胆管细胞癌组织中Gli-1和Snail高度表达，且与血管侵犯和淋巴结转移相关，表明Hh信号通道和EMT异常可能与肝胆管细胞癌侵袭和转移有关。

表1 胆管细胞癌组织及癌旁组织、正常组织中Gli-1及Snail蛋白的表达情况

表2 Gli-1、Snail蛋白的表达与胆管细胞癌临床病理的关系

表3 Gli-1与Snail蛋白的表达相关性例

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.03.027

R735；R446.6

A

1671-0800（2016）03-0332-03

2015-11-15

（本文编辑：陈志翔）

宁波市自然科学基金（2012A610198）

315010宁波，宁波市第二医院（章维）；宁波大学附属鄞州医院（张苗尊、李明主、郑必春、顾昕）

张苗尊，Email：idreamof 333@126.com