结合低场核磁共振分析反复冻融处理对肉鸡不同部位肌肉品质的影响

朱学伸，黄雪方，鲁小讯，王 艳，赵凯斌，徐 铭，王仁雷*

（江苏第二师范学院生命科学与化学化工学院，江苏省生物功能分子重点建设实验室，江苏 南京 210013）

结合低场核磁共振分析反复冻融处理对肉鸡不同部位肌肉品质的影响

朱学伸，黄雪方，鲁小讯，王 艳，赵凯斌，徐 铭，王仁雷*

（江苏第二师范学院生命科学与化学化工学院，江苏省生物功能分子重点建设实验室，江苏 南京 210013）

利用低场核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技术研究反复冻融处理对肉鸡不同部位肌肉品质的影响。结果表明，反复冻融期间pH值变化不显著（P＞0.05）。随着冻融次数的增加，肉鸡胸肉和腿肉解冻汁液损失显著下降（P＜0.05），硫代巴比妥酸反应物质（thiobabituric acid reactive substance，TBARS）值显著增大，总蛋白溶解度以及肌原纤维小片化冻融初期呈现上升趋势，总水分含量均逐渐降低。低场核磁共振T2弛豫时间分析显示，其自由水占比显著下降（P＜0.05）。以上结果说明反复冻融使解冻汁液损失伴随自由水比例显著下降而逐步降低，由于肌肉pH值保持稳定，推测反复冻融过程中反复形成的冰晶对肌肉微观结构的破坏，尤其对肌原纤维蛋白质溶解度的影响起到一定的作用。

低场核磁共振；反复冻融；肉鸡；肌肉品质

现代肉鸡生长周期短，产肉率高，但食用品质有所下降。而且市场上基本上以大量的冰鲜、冷冻鸡肉为主，客观上无法避免运输、贮藏和销售过程造成现冻融过程，继而导致肌肉蛋白质特征的变化以及保水性变差［1-2］。低场核磁共振技术已经应用于肉品持水性的研究，通过检测肉品中1H质子的弛豫时间来获得肉品中的水分分布的信息。弛豫时间越短，表示水与底物结合越紧密，否则表明水分越自由，所以可以用弛豫时间间接表明水分的自由度，从而分析冻融对肌肉品质的影响［3］。李玫等［4］利用低场核磁共振分析了鸡胸肉在不同冻融循环和冻融时间下的品质变化，发现冻融循环及冻藏时间的延长会显著影响鸡胸肉色泽及持水力等食用品质，其中T21与亮度值及冻融次数间显著相关且与解冻损失、心损失等持水性指标高度负相关，其结果与韩敏义等［5］报道的随着冻融次数的增加肉鸡肌肉解冻损失和蒸煮损失均显著增加不一致。根据李金平等［6］报道的随着反复冻融次数的增加牛外脊肉解冻时间缩短，解冻损失逐渐增大；而戚军等［7］研究得出随着冻融次数增加，羊肉解冻损失逐渐增加，但蒸煮损失逐步降低，可以看出以上报道结果存在的差异。目前，结合核磁共振研究反复冻融对蛋白特性和保水性的影响研究报道较少，从工厂到顾客的消费过程中冻融次数一般在数次内，因此十分有必要从水分状态和肌原纤维蛋白特性角度，分析数次反复冻融对肉鸡不同部位肌肉品质的变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三黄肉鸡（12 周龄，6 只）宰后4 h分别分离出鸡胸肉及腿肉。冷冻条件：温度为-20 ℃，24 h；解冻条件：温度为5 ℃，24 h。分别于反复冻融0（冻融前）、1、2、3 次后取样用于指标分析。

氯化钾、磷酸钾、氯化镁、三氯乙酸（均为分析纯）上海国药集团化学试剂有限公司；碘乙酸、硫代巴比妥酸（thiobabituric acid，TBA）、乙二胺四乙酸、叠氮化钠 南京生兴生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

DW-FL270低温冰箱 中科美菱低温科技股份有限公司；KA62NV20TI冰箱 中国海尔集团；PB10 pH计德国Satorious公司；5804R高速离心机 德国Eppendorf公司；FSH-2高速匀浆器 江苏省金坛市环宇科学仪器厂；T6紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Micro MR核磁共振分析仪 上海纽迈电子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pH值测定

肌肉pH值是通过测定肉样提取物的pH值得到。提取物处理方法：1 g肉样在10 mL的5 mmol/L碘乙酸溶液中用剪刀剪碎后匀浆［2］。校正及测定均在室温下进行。

1.3.2 解冻汁液损失测定

肌肉准确称质量（m1）后密封在自封袋中，-20 ℃冻结24 h之后于5 ℃条件下解冻并保存24 h，取出擦干并准确称质量（m2）。试样解冻汁液损失按如下公式进行计算。

1.3.3 水分含量的测定

按照GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》的直接干燥法，干燥温度为103 ℃。测得容器加试样的质量m1，容器加干燥后试样的质量m2，容器质量m3。容器为称量瓶，事先进行过干燥处理。试样中水分含量按如下公式进行计算。

1.3.4 硫代巴比妥酸反应物值（thiobabituric acid reactive substance，TBARS）测定

参照黄鸿兵等［3］的方法，略有修改。取2 g肉样，加入5 mL 25%三氯乙酸和4 mL蒸馏水，高速匀浆1 min之后1 000×g离心20 min，上清液通过滤纸过滤；取2 mL滤液加2 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸沸水浴20 min，流水冷却5 min，于532 nm波长处测定溶液吸光度。其中空白样为1 mL三氯乙酸+1 mL蒸馏水+2 mL 0.02 mol/L TBA。TBARS以丙二醛含量计算，计算公式如下。

TBARS/（mg/kg）=A532nm×9.48 （3）1.3.5 肌原纤维小片化指数（myofibrillar fragmentation index，MFI）测定

准确称取2 g肉样，加入20 mL 4 ℃的MFI抽提缓冲液（100 mmol/L 氯化钾、20 mmol/L 磷酸钾、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L 氯化镁、1 mmol/L叠氮化钠，pH 7.0），用手术剪刀剪碎后匀浆60 s；匀浆液在4 ℃条件下离心15 min（转速为4 000 r/min），弃去上清保留沉淀。沉淀中加入20 mL 冰冷的MFI缓冲液后匀浆得到悬浮液，之后通过4 层纱布过滤，滤液即为肌原纤维提取液。使用双缩脲法测其蛋白质浓度，然后用MFI抽提缓冲液把肌原纤维提取液蛋白质量浓度调为0.5 mg/mL，测定该溶液在540 nm波长处吸光度。MFI按下式计算［10］。

参照Joo等［4］的方法进行总蛋白和肌浆蛋白溶解度测定分析。准确称取1.0 g肉样加10 mL 4 ℃预冷提取液（1.1 mol/L KI、0.1 mol/L K3PO4，pH 7.2），剪碎后匀浆1 min，4 ℃摇动抽提16 h，于4 ℃、4 500 r/min离心20 min，上清液用双缩脲法测定蛋白质量浓度即为总蛋白溶解度（mg/g）；之后准确称取1.0 g肉样加10 mL 4 ℃预冷提取液（0.025 mol/L K3PO4，pH 7.2），剪碎后匀浆1 min，4 ℃摇动抽提16 h，于4 ℃、4 500 r/min离心20 min，上清液用双缩脲法测定蛋白质量浓度，得到肌浆蛋白溶解度（mg/g）。

1.3.7 低电场核磁共振分析

低电场核磁共振分析条件主要是参照戚军等［7］的测试方法进行。具体测试条件如下：质子共振频率为22 MHz，测量温度为32 ℃。准确称取2.0 g肉样放入核磁管后放入分析仪中。自旋-自旋弛豫时间T2用CPMG序列进行测量。所使用的参数为：τ值（90b脉冲和180b脉冲之间的时间）为200 μs。NMR弛豫测量得到的图为自由诱导指数衰减曲线，其数学模型为：

式中：A（t）表示衰减到时间t时的幅值；A0为平衡时的幅值；T2i为第i个组分的自旋-自旋弛豫时间。CMPG指数衰减曲线用仪器自带的MultiExp InvAnalysis软件进行反演，得到T2值。该软件使用综合迭代算法，结果为离散型与连续型相结合的T2谱。反演得到弛豫幅值、峰值及每个峰所占的面积分数、起始时间和结束时间等。采用弛豫图每个组分峰值对应的时间作为T2。

1.4 统计分析

所有实验数据方差分析均采用SPSS统计软件。每个指标测定重复3 次，数据结果以±s表示。

2 结果与分析

2.1 不同冻融次数对肌肉品质的影响

许多酒店企业已逐渐意识到知识型员工在酒店战略与经营决策中的重要作用，有的酒店发现问题后不惜重金聘用海外高级人才。但是目前在国内仍有许多中规中矩不愿求新的酒店的激励理念还比较落后，与国外发达国家酒店和国内的外资酒店相比，存在一定的误区和问题。

2.1.1 pH值

由图1可知，鸡胸肉反复冻融0、1、2、3 次时的 pH 值没有显著变化，其pH值维持在5.79左右；对于鸡腿肉来说，冻融0、1、2、3 次pH值上下波动，但不显著，其pH值维持在6.33左右。在整个冻融过程中，鸡腿肉的pH值都显著高于鸡胸肉（P＜0.05），这是由于肌肉类型与组成不同。胸肉主要由白肌纤维组成，富含糖原，而腿肉主要由红肌纤维组成，主要含有大量有氧代谢酶。本次实验中反复冻融过程中，宰后4 h肌肉已经接近极限pH值，糖酵解过程受到反复冻融影响较小［12］。

2.1.2 解冻汁液损失

由图2可知，随着冻融次数增加，鸡胸肉解冻汁液损失逐渐下降，差异显著（P＜0.05），鸡腿肉解冻汁液损失也表现为下降，但后期差异不显著。冻融1 次后胸肉解冻汁液损失显著高于腿肉，之后与腿肉间差异不显著。该结果与冉俊等［13］报道的猪肉15 次的冻融过程中解冻汁液损失变化趋势不同，由此可以看出冻融次数的显著增加一定程度上也可影响解冻损失的变化趋势，反复冻融导致肉品水分大量流失，冻融次数越多，水分累积损失越大。李媛惠等［14］研究发现反复冻融同样对蒸煮损失也有显著影响，鸡骨肉相连冻融1 次前后蒸煮损失相比差异显著。与冻融3 次相比，冻融4、5 次后蒸煮损失率显著下降；冻融过程中，肌细胞结构受到一定破坏和蛋白质特性发生变化，可能是导致保水能力呈现下降趋势的主要原因。

2.1.3 水分含量

由图3可知，随着冻融次数增加，胸肉中水分含量逐步减少，差异显著（P＜0.05）；而腿肉在冻融处理后水分含量整体呈现下降趋势，但差异不显著（P＞0.05），本实验结果发现反复冻融第1次前后水分含量变化较大。腿肉与肌肉变化略微不同原因可能跟肌肉中结缔组织含量有关，而腿肉结缔组织含量显著高于胸肉，一定程度上可以维持肌肉的保水性。肉品中水分含量在74%左右，是反映肉品品质的一个重要指标。肉品中水分含量的减少一定程度上反映了肉品品质在反复冻融过程中降低［15］。

2.1.4 TBARS值

由图4可知，随着冻融次数增加，鸡胸肉和腿肉中TBARS值均显著增加（P＜0.05），说明肌肉中脂肪氧化加速。肉品中的脂肪氧化大多发生在细胞膜水平上，反复冻融过程中，细胞中冰晶多次重新形成，会损坏肌细胞的结构，使得肌纤维细胞丧失完整性，进而加速了脂肪氧化。本实验结果与已有研究认为TBARS值最主要的影响因素是冷冻时间，其值随着冷冻贮藏时间或反复冻融次数的增加而变大［9］的结论一致。

2.1.5 肌原纤维小片化指数

由图5可知，鸡胸肉MFI的值呈先上升后下降的趋势，但差异不显著（P＞0.05）。腿肉MFI在第1次冻融显著上升，之后差异不显著（P＞0.05）。胸肉MFI显著高于腿肉。反复冻融过程中，随着冻融次数的增加，MFI的变化趋势说明肌原纤维的结构发生了一定的变化，推测造成以上变化的部分原因跟冻融过程中反复形成的冰晶对肌丝微观结构破坏作用有关［16］。肌原纤维结构小片化一定程度上会导致蛋白质溶解度的提升，宰后肌肉微观结构的变化同样受到凋亡酶、组织蛋白酶等一系列组织内源酶的影响，以上过程一定程度也影响了MFI变化趋势［17］。

2.1.6 蛋白质溶解度

反复冻融过程中，随着冻融次数的增加，肌浆蛋白溶解度在3 次反复冻融过程中对比变化不显著（P＞0.05）（图6A），但均呈现一定的下降趋势，而该过程中胸肉肌浆蛋白溶解度一直显著高于腿肉肌浆蛋白溶解度（P＜0.05）；随着冻融次数的增加肉鸡肌肉总蛋白溶解度逐渐升高（图6B），尤其肉鸡腿肉总蛋白溶解度变化尤为显著（P＜0.05），肉鸡胸肉和腿肉间总蛋白溶解度差异不显著。反复冻融一定程度上可以提高肌肉蛋白质溶解度，主要是由于冰晶的反复形成会破坏肌细胞完整结构，更利于提取细胞中的蛋白质［18］，2.1.5节中肌原纤维小片化的变化一定程度上可能也说明了肌丝微观结构被破坏。另外本实验发现肌浆蛋白变化并不显著，其主要原因可能在于反复冻融第1次后肌浆蛋白便伴随大量解冻汁液流出，另外冻结过程中蛋白质分子由于发生聚集而变性也可能是部分的原因［16］。

2.2 低场核磁共振分析水分状态

2.2.1 水分组成变化

由图7可知，NMR T2弛豫测量结果显示有3 个峰，分别代表了肌肉中的3 种主要组分的水。各个峰面积占总峰面积的比例可以相应地代表结合水、不易流动水和自由水含量［19］。峰1、2、3分别用T2b、T21、T22表示，依次代表结合水、不易流动水和自由水。由表1可知，随着反复冻融的进行，不易流动水含量显著上升（P＜0.05）；自由水含量显著下降（P＜0.05）；结合水含量几乎无变化。以上研究结果与李媛惠等［14］报道的结果一致。本实验研究结果显示冻融过程中结合水含量稳定不变，鸡胸肉维持在0.03%，腿肉保持在0.02%。结合水是与蛋白质分子表面紧密结合的水分子层，不易解离和蒸发，不易受肌肉蛋白质结构以及电荷变化的影响，甚至严重的外力条件也不能改变结合状态。结合水对肌肉的保水性没有影响。分别冻融1、2、3 次后，鸡胸肉和腿肉中自由水比例呈显著下降趋势（P＜0.05），自由水存在于肌细胞外间隙中，靠毛细管力作用存在于肌肉中［21］。反复冻融过程中，由于肌细胞受到冰晶的物理性破坏，自由水以解冻汁液的形式流失，从而其含量显著下降。该规律与戚军等［7］在羊肉冻融实验中得到结果一致。

2.2.2 水分自由度

表2显示了不同冻融次数鸡肉中水分横向弛豫时间的T2变化，可以看出胸肉和腿肉T2b（结合水）在反复冻融过程中无明显差异。而胸肉和腿肉中T21（不易流动水）自冻融1、2 次后减小，胸肉差异不显著而腿肉差异显著。T21随冻融次数增加而下降可能是由于冻融使肌原纤维蛋白分子空间结构发生了变化，即高级构象发生改变，从而影响其与水分子的结合能力，另外与解冻时汁液的流失有关［22］，也说明冻融后T21对应水分的移动性即自由度下降了，因为T21时间越短，表示水与底物结合越紧密。T22（自由水）在胸肉和腿肉中变化过程一致：呈现为先上升但后下降，说明此部分的水分移动性存在波动，最终变小，以上结果与Bertram等［23］的部分研究结果一致。

3 结 论

反复冻融中鸡肉解冻汁液损失逐步降低，同时伴随着肌肉中自由水比例的下降。需要指出的是，该过程中反复冻融对肌肉pH值影响不大，但由于肌肉中冰晶反复产生对肌丝微观结构，尤其可能对肌原纤维蛋白分子空间构象变化有影响，最终一定程度上影响肌肉保水性。反复冻融过程中的肌肉蛋白质具体的变化情况仍有待于进一步详细的研究。

［1］ 施雪， 夏继华， 卢进峰， 等. 冻结、解冻过程对肌肉品质的影响［J］. 食品工业， 2012， 33（7）： 21-24. DOI：10.13386/ j.issn1002-0306.2012.13.049.

［2］ 常海军， 牛晓影， 周文斌. 不同冻融次数对猪肉品质的影响［J］. 食品科学， 2014， 35（15）： 43-48. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201415009.

［3］ 杨赫鸿， 李沛军， 孔保华， 等. 低场核磁共振技术在肉品科学研究中的应用［J］. 食品工业科技， 2012， 33（13）： 400-405. DOI：10.13386/ j.issn1002-0306.2012.13.049.

［4］ 李玫， 李苗云， 赵改名， 等. 冻融循环下鸡肉品质变化的低场核磁共振研究［J］. 食品科学， 2013， 34（11）： 58-61. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201311014.

［5］ 韩敏义， 刘志勤， 刘岳， 等. 反复冻融对鸡肉品质的影响［J］.江苏农业学报， 2013， 29（1）： 167-171. DOI：10.3969/ j.issn.1000-4440.2013.01.029.

［6］ 李金平， 李春保， 徐幸莲， 等. 反复冻融对牛外脊肉品质的影响［J］. 江苏农业学报， 2010， 26（2）： 406-410. DOI：10.3969/ j.issn.1000-4440.2010.02.033.

［7］ 戚军， 高菲菲， 李春保， 等. 低场 NMR 研究冻融过程中羊肉持水力的变化［J］. 江苏农业学报， 2010， 26（3）： 617-622. DOI：10.3969/ j.issn.1000-4440.2010.03.033.

［8］ BENDALL J R. Relations between muscle pH and important biochemical parameters during the postmortem changes in mammalian muscles［J］. Meat Science， 1979， 3（2）： 143-157. DOI：10.1016/0309-1740（79）90016-0.

［9］ 黄鸿兵， 徐幸莲， 周光宏. 冷冻贮藏对冻猪肉冰晶形态、TVB-N及TBARS的影响［J］. 食品工业科技， 2008， 29（2）： 117-119. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2008.02.028.

［10］ 吴菊清， 李春保， 周光宏， 等. 宰后成熟过程中冷却牛肉、猪肉色泽和嫩度的变化［J］. 食品科学， 2008， 29（10）： 136-139. DOI：10.3321/ j.issn：1002-6630.2008.10.026.

［11］ JOO S T， KAUFFMAN R G， KIM B C， et al. The relationship of sarcoplasmic and myofibrillar protein solubility to colour and waterholding capacity in porcine longissimus muscle［J］. Meat Science，1999， 52（3）： 291-297. DOI：10.1016/S0309-1740（99）00005-4.

［12］ 朱学伸， 陆亚宇， 黄雪方. 宰后猪PSE肉特征形成与初期温度的关系［J］. 现代食品科技， 2014， 30（7）： 69-73. DOI：10.13982/ j.mfst.1673-9078.2014.07.025.

［13］ 冉俊， 李凤. 反复冻融对猪肉品质特性的影响［J］. 农业科技与信息，2012（8）： 26-28. DOI：10.3969/j.issn.1003-6997.2012.08.014.

［14］ 李媛惠， 李苗云， 赵改名， 等. 反复冻融对调理鸡肉骨肉相连品质的影响［J］. 河南农业大学学报， 2013， 47（2）： 187-191. DOI：10.3969/ j.issn.1000-2340.2013.02.015.

［15］ ZHOU G H， XU X L， LIU Y. Preservation technologies for fresh meat：a review［J］. Meat Science， 2010， 86（1）： 119-128.

［16］ 夏秀芳， 孔保华， 郭园园， 等. 反复冷冻-解冻对猪肉品质特性和微观结构的影响［J］. 中国农业科学， 2009， 42（3）： 982-988. DOI：10.3864/ j.issn.0578-1752.2009.03.029.

［17］ 王春青， 李侠， 张春晖， 等. 肌原纤维特性与鸡肉原料肉品质的关系［J］. 中国农业科学， 2014， 47（10）： 2003-2012. DOI：10.3864/ j.issn.0578-1752.2014.10.014.

［18］ 牛力. 冻结和冻藏对鸡胸肉食用品质的影响［D］. 南京： 南京农业大学， 2012.

［19］ HAZLEWOOD C F， CHANG D C， NICHOLS B L， et al. Nuclear magnetic resonance transverse relaxation times of water protons in skeletal muscle［J］. Biophysical Journal， 1974， 14（8）： 583-606. DOI：10.1016/S0006-3495（74）85937-0.

［20］ BERTRAM H C， WHITTAKER A K， SHORTHOSE W R， et al. Water characteristics in cooked beef as influenced by ageing and highpressure treatment-an NMR micro imaging study［J］. Meat Science，2004， 66（2）： 301-306. DOI：10.1016/S0309-1740（03）00103-7.

［21］ BERTRAM H C， PURSLOW P P， ANDERSEN H J. Relationship between meat structure， water mobility， and distribution： a low-field nuclear magnetic resonance study［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2002， 50（4）： 824-829. DOI：10.1021/jf010738f.

［22］ BERTRAM H C， KARLSSON A H， RASMUSSEN M， et al. Origin of multiexponential T2relaxation in muscle myowater［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2001， 49（6）： 3092-3100. DOI：10.1021/jf001402t.

Effect of Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Broiler Breast and Thigh Muscles as Evaluated by Low-Field Nuclear Magnetic Resonance

ZHU Xueshen， HUANG Xuefang， LU Xiaoxun， WANG Yan， ZHAO Kaibin， XU Ming， WANG Renlei*
（Jiangsu Key Laboratory of Biofunctional Molecule， School of Life Science and Chemistry， Jiangsu Second Normal University，Nanjing 210013， China）

In the present study， the effect of freeze-thaw cycles on the quality of broiler breast and thigh muscles was explored by low-field nuclear magnetic resonance （LF-NMR）. Results showed that thaw exudate loss of chicken breast and thigh muscles significantly declined with increasing number of freeze-thaw cycles （P < 0.05）， whereas no significant change in pH was observed （P > 0.05）. The thiobabituric acid reactive substance （TBARS） value of chicken breast and thigh muscles rose significantly， and total protein solubility and myofibrillar fragmentation index （MFI） showed an increasing trend initially. However， total water content gradually fell. At the same time， the proportion of free water as indicated by LF-NMR T2relaxation times significantly dropped. These above results suggested that freeze-thaw cycles resulted in a reduced proportion of free water and consequently enhanced loss of thaw exudate in chicken muscles. pH maintenance during freezethaw cycles confirmed that ice crystal formation caused damage to the microstructure of muscles， especially having a certain influence on the solubility of myofibrillar protein.

low-field nuclear magnetic resonance （LF-NMR）； freeze-thaw cycles； broiler； meat quality

10.7506/spkx1002-6630-201609005

TS251.1

A

1002-6630（2016）09-0023-06

朱学伸， 黄雪方， 鲁小讯， 等. 结合低场核磁共振分析反复冻融处理对肉鸡不同部位肌肉品质的影响［J］. 食品科学，2016， 37（9）： 23-28. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609005. http：//www.spkx.net.cn

ZHU Xueshen， HUANG Xuefang， LU Xiaoxun， et al. Effect of freeze-thaw cycles on the quality of broiler breast and thigh muscles as evaluated by low-field nuclear magnetic resonance［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 23-28. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609005. http：//www.spkx.net.cn

2015-05-15

国家自然科学基金青年科学基金项目（31301507）；江苏省高校自然科学基金面上项目（13KJB550006）

朱学伸（1984—），男，副教授，博士，研究方向为食品科学。E-mail：xueshen_zhu@163.com

*通信作者：王仁雷（1963—），男，教授，博士，研究方向为生物功能分子。E-mail：wrl3501988@163.com