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银耳芽孢总蛋白提取方法的建立

2016-11-14朱涵予许丹云张丽姣马爱民

食品科学 2016年9期
关键词:沉淀法银耳液氮

刘 洋,朱涵予,许丹云,张丽姣,马爱民*

(华中农业大学食品科学技术学院,湖北 武汉 430070)

银耳芽孢总蛋白提取方法的建立

刘 洋,朱涵予,许丹云,张丽姣,马爱民*

(华中农业大学食品科学技术学院,湖北 武汉 430070)

采用超声波与高压均质破碎细胞,通过显微观察细胞破碎效果、Bradford法测定蛋白含量并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,比较了三羟甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane,Tris)-饱和酚法、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)-丙酮沉淀法及Tris-饱和酚结合TCA-丙酮沉淀法提取银耳芽孢总蛋白的效果。结果表明:高压均质的细胞破碎效果优于超声波,3 种方法所得到的银耳芽孢总蛋白质量浓度分别为2.33、1.26、1.02 mg/mL,且Tris-饱和酚法经传统考马斯亮蓝染色法染色所得电泳条带亮度及清晰度均优于其他两种方法。因此,Tris-饱和酚法是进行银耳芽孢总蛋白提取的一种有效方法。

银耳;芽孢;蛋白提取方法

银耳(Tremella fuciformis),又名白木耳,是一种著名的药食两用真菌,富含多糖、蛋白质、维生素及无机盐,被誉为“菌中之冠”[1]。在医药领域,银耳多糖具有提高免疫、抗肿瘤、抗氧化及抗衰老等生理功能,如减轻化疗和放疗的毒副反应,增强疗效,提高癌症患者的生存质量及延长生存期[2-3];银耳多糖中的特定成分在临床上可与其他药物配伍用于治疗放疗、化疗或其他原因引起的白细胞减少症,亦可作为放射损伤的辅助治疗;银耳酚酸具有抗氧化及抗炎作用等生理功能[4]。在食品加工领域,银耳可被添加到食品中以改善其感官特性及提高营养价值,如Cha Minha等[5]在肉馅的制作中添加银耳子实体既能降低油腻度又能提高肉馅的持油性;Tseng等[6]在制作面包时用银耳子实体代替5%的小麦粉,其感官特性可被接受且营养价值得到了提高;Ulziijargal等[7]进一步用银耳菌丝体代替子实体制作面包,也能取得同样的效果。

长期以来对于银耳生理功能的研究主要集中在银耳多糖及酚酸等方面,而蛋白质作为银耳中第二大类营养成分,对其生理功能的研究较少[8]。银耳总蛋白的有效提取是进行银耳蛋白质生理功能研究的重要前提,不同食用菌材料的最适提取方法不同[9],黄碧芳等[10]在对虎奶菇菌丝体自溶蛋白质制备方法的研究中,比较了超声波和液氮研磨两种细胞破碎方法,发现液氮研磨得到的粗蛋白和纯蛋白产量均高于超声波法;刘靖宇[11]在草菇菌丝及子实体总蛋白的提取中采用了三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)-丙酮沉淀法;刘晓云等[12]在灵芝子实体原基总蛋白质的提取中,比较了三羟甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane,Tris)-饱和酚法和TCA-丙酮沉淀法的提取效果,而有关银耳总蛋白的提取目前却鲜有报道。

银耳芽孢是银耳担孢子产生的酵母状分生孢子,俗称“芽孢”(yeast-like conidia,YLC),比菌丝体及子实体更易获得[13]。本研究以银耳芽孢为材料,在液氮研磨的基础上分别采用超声波与高压均质进行细胞破碎,比较Tris-饱和酚法、TCA-丙酮沉淀法及Tris-饱和酚结合TCA-丙酮沉淀法3 种方法提取银耳芽孢总蛋白的效果,旨在建立一种有效的银耳芽孢总蛋白提取方法,为后续银耳蛋白质生理功能的探索、蛋白质组学的研究及在食品加工中的应用奠定基础。

1 材料与方法

银耳3号芽孢 华中农业大学食品科学技术学院食品微生物实验室保存。

马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基、马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth,PDB)培养基 青岛日水生物技术有限公司。

硫脲、脲、TCA、甲醇、乙醇、乙酸铵、Tris、HCl、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、冰醋酸、硝酸银 国药集团化学试剂有限公司;3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate,CHAPS)、二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF) 合肥Biosharp公司;丙酮 天津市天力化学试剂有限公司;载体两性电解质 北京酷来搏科技有限公司;考马斯亮蓝R-250、Tris-饱和酚 北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

台式冷冻离心机 美国Beckman公司;AH-100B高压均质机 安拓思纳米技术(苏州)有限公司;超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司;凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司;UV-1800紫外-可见分光光度计 日本Shimadzu公司;超低温冰箱 美国Thermo Fisher Scientific公司;显微成像系统 德国Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 银耳芽孢的培养[14]

传统制造业需要积极适应数字化转型所带来的变革,用发展的眼光看待变革,做好充分准备,找准目标分步实施,为数字化转型赋能。

将保藏的银耳3号芽孢菌种转管于PDA培养基上,活化3~6 d,接入装有100 mL PDB培养基的250 mL三角瓶中。于25 ℃摇床上120 r/min培养3~5 d,10 000 r/min离心20 min,蒸馏水冲洗,再次离心,冷冻干燥后保存于-20 ℃冰箱,备用。

1.3.2 银耳芽孢总蛋白的提取

1.3.2.1 Tris-饱和酚法[12,15-16]

称取0.1 g银耳芽孢,液氮研磨后,加5 mL抽提液(0.1 mol/L pH 8.8 Tris-HCl、0.01 mol/L EDTA、0.01 mol/L PMSF、0.05 mol/L DTT,下同)。经195 W、10 min或120 MPa、5 min破碎后,4 ℃、12 000 r/min条件下离心30 min,保留上清液。按1∶1(V/V)加入Tris-饱和酚,室温混悬后4 ℃、12 000 r/min条件下离心30 min,保留酚相。在酚相中加入0.1 mol/L pH 8.8 Tris-HCl及0.01 mol/L DTT后再加入4 倍体积甲醇(含0.01 mol/L 乙酸铵(乙酸铵-甲醇(1∶24,V/V))及0.01 mol/L DTT(DTT-甲醇(1∶480,V/V))),-80 ℃沉淀1 h以上,4 ℃、12 000 r/min条件下离心30 min。沉淀用预冷的90%乙醇(含0.01 mol/L DTT(DTT-乙醇(1∶100,V/V))洗涤2~3 次,4 ℃、12 000 r/min离心20 min。蛋白沉淀物室温干燥后,加入溶解液(8.5 mol/L脲、2.5 mol/L硫脲、5% CHAPS、1%载体两性电解质、0.1 mol/L DTT,下同)中,室温混悬1 h,4 ℃、12 000 r/min条件下离心30 min,上清即为蛋白质样本溶液。

1.3.2.2 TCA-丙酮沉淀法[17-19]

称取0.1 g银耳芽孢,液氮研磨后,加入5 mL裂解液(7 mol/L脲、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、0.5%载体两性电解质、0.05 mol/L DTT、蛋白酶抑制剂混合物,下同)。经195 W、10 min或120 MPa、5 min破碎后,4 ℃、12 000r/min条件下离心30 min,保留上清。加入5倍体积预冷的10 g/100 mL TCA-丙酮溶液,混匀后-20 ℃冰浴30 min。4 ℃、12 000 r/min条件下离心30 min,弃上清。沉淀用预冷的丙酮洗涤2~3 次,4 ℃、12 000 r/min条件下离心20 min,去除残留的TCA和丙酮。蛋白沉淀物室温干燥后,加入溶解液中,超声波使其充分溶解,室温混悬1 h,4 ℃、12 000 r/min条件下离心30 min,上清即为蛋白质样本溶液。

1.3.2.3 Tris-饱和酚结合TCA-丙酮沉淀法[20]

称取0.1 g银耳芽孢,液氮研磨后,加入5 mL裂解液。经195 W、10 min或120 MPa、5 min破碎后,4 ℃、12 000 r/min条件下离心30 min,保留上清。加入5 倍体积预冷的10 g/100 mL TCA-丙酮溶液,混匀后-20 ℃冰浴30 min。4 ℃、12 000 r/min条件下离心30 min,弃上清。沉淀用预冷的丙酮洗涤2~3 次,4 ℃、12 000 r/min条件下离心20 min,去除残留的TCA和丙酮。沉淀室温干燥后,加入5 mL抽提液,4 ℃、12 000 r/min条件下离心30 min,保留上清。按1∶1(V/V)加入5 mL Tris-饱和酚,室温混悬后4 ℃、12 000 r/min条件下离心30 min,保留酚相。在酚相中加入0.1 mol/L pH 8.8 Tris-HCl及0.01 mol/L DTT后再加入4 倍体积甲醇(含0.01 mol/L乙酸铵及0.01 mol/L DTT),-80 ℃沉淀1 h以上,4 ℃、12 000 r/min条件下离心30 min。沉淀用预冷的90%乙醇(含0.01 mol/L DTT)洗涤2~3 次,4 ℃、12 000 r/min条件下离心20 min。蛋白沉淀物室温干燥后,加入溶解液中,室温混悬1 h,4 ℃、12 000 r/min离心30 min,上清即为蛋白质样本溶液。

1.3.3 细胞破碎效果的显微观察

将未作处理组、液氮研磨处理组、液氮研磨/超声波处理组及液氮研磨/高压均质处理组样品的细胞破碎效果应用显微成像系统进行观察。

1.3.4 蛋白质含量的测定

采用Bradford法[21]测定样品中蛋白质的含量,取3 次重复。

1.3.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)分析

1.3.5.1 凝胶的制备及电泳

按照谷歌生物科技公司SDS-PAGE凝胶制备试剂盒进行凝胶制备,浓缩胶质量分数为5%,分离胶质量分数为12%。

1.3.5.2 染色及脱色

采用传统考马斯亮蓝染色法[22]、改良考马斯亮蓝染色法[23]及硝酸银染色法[24]3 种方法进行染色,3 种染色液配方见表1。

2 结果与分析

2.1 细胞破碎效果的显微观察

由图1可知,未作处理的银耳芽孢主要呈圆形或椭圆形结构,有的成链状结构,与未作处理的样品相比,经液氮研磨、液氮研磨/超声波及液氮研磨/高压均质处理后的细胞均受到不同程度的破碎。其中,经液氮研磨处理后的细胞破碎效果不是很明显,芽孢基本保留了圆形或椭圆形结构,只是链状结构明显减少;经液氮研磨/超声波处理后的细胞破碎效果较为明显,呈链状结构的芽孢基本消失,且可观察到少量细胞破碎的碎片;经液氮研磨/高压均质处理后的细胞基本变成细胞碎片,只有极少数呈圆形或椭圆形结构的芽孢存在,可以看出3 种方法的细胞破碎效果依次增强。因此,由细胞破碎效果的显微观察结果可以看出液氮研磨/高压均质破碎细胞的效果最佳。

2.2 细胞破碎效果的SDS-PAGE分析

由图2可知,在Tris-饱和酚法和TCA-丙酮沉淀法中,经高压均质后所提取的银耳芽孢总蛋白电泳条带亮度与清晰度均优于超声波,且在TCA-丙酮沉淀法中效果更为明显,因此在后续研究中采用高压均质进行细胞破碎。

2.3 蛋白质含量测定结果

由图3可知,Tris-饱和酚法、TCA-丙酮沉淀法和Tris-饱和酚结合TCA-丙酮沉淀法这3 种方法所得到的银耳芽孢总蛋白质质量浓度分别为2.33、1.26、1.02 mg/mL。Tris-饱和酚法提取的银耳芽孢总蛋白质质量浓度明显高于其他两种方法。究其原因,可能是TCA-丙酮沉淀法经历了溶解、沉淀、再溶解的复杂过程,沉淀后的蛋白质再溶解较为困难,从而引起银耳芽孢总蛋白大量丢失[25-26]。Tris-饱和酚结合TCA-丙酮沉淀法所得银耳芽孢总蛋白质质量浓度最低,虽与TCA-丙酮沉淀法的缺陷有关,但更重要的原因可能是操作步骤过于繁琐、周期过长,以致银耳芽孢总蛋白大量丢失。而在Tris-饱和酚法中,酚是蛋白质的良好溶剂,蛋白质和脂类溶于酚相,盐、核酸、多酚和多糖等可溶性物质进入水相,从而得以分离。酚层中的蛋白质通过乙酸铵的甲醇溶液沉淀进一步纯化。乙酸铵在乙醇等有机溶剂中溶解性较好,因而可在沉淀洗涤过程中被除去,避免了重新引入离子。并且Tris-饱和酚法得到的蛋白质沉淀溶解性优于TCA-丙酮沉淀法,前者只需要稍微振荡便可使沉淀溶于溶解液中,后者需使用超声波助溶。虽经超声波助溶,蛋白质沉淀都溶于溶解液中,但离心后,蛋白质又重新沉淀下来,表明超声波可能并不能真正使蛋白溶解。Tris-饱和酚法所得蛋白质沉淀溶解后再离心,蛋白质不会重新沉淀下来[27]。结果表明,采用Tris-饱和酚法提取的银耳芽孢总蛋白样品的稳定性和重复性均非常高。

2.4 SDS-PAGE分析

将3 种方法所提取的银耳芽孢总蛋白进行了SDSPAGE分析,并采用传统考马斯亮蓝染色法、改良考马斯亮蓝染色法及硝酸银染色法3 种方法进行染色,结果如图4所示。

由图4可知,3 种方法均能较为有效地提取出银耳芽孢总蛋白,就提取效果而言,Tris-饱和酚法所得蛋白质含量最高,电泳条带清晰且分辨率高,但毒性较强且耗时;TCA-丙酮沉淀法所得蛋白质含量及电泳条带清晰度虽不及前者,但操作简便且省时;Tris-饱和酚结合TCA-丙酮沉淀法所得蛋白质含量及电泳条带清晰度均不及前两种方法,操作最为繁琐且最耗时,因此Tris-饱和酚法可作为银耳芽孢总蛋白提取的一种有效方法。就染色效果而言,传统考马斯亮蓝染色法所得电泳条带较为清晰,但所使用的甲醇有毒;改良考马斯亮蓝染色法是用乙醇代替甲醇,降低了毒性,但条带清晰度却不及传统方法;硝酸银染色法灵敏度较高,特别是在低分子质量区间染色效果尤为明显,但在高分子质量区间电泳条带分辨率较低,因此选择传统考马斯亮蓝染色法作为本研究的染色方法。

3 结 论

本研究采用超声波与高压均质破碎细胞,通过Bradford法测定银耳芽孢总蛋白质量浓度并进行SDS-PAGE分析,比较了Tris-饱和酚法、TCA-丙酮沉淀法及Tris-饱和酚结合TCA-丙酮沉淀法提取银耳芽孢总蛋白的效果。结果表明:高压均质破碎细胞的效果优于超声波,Tris-饱和酚法在蛋白质量浓度及电泳条带清晰度方面均优于其他两种方法,因此Tris-饱和酚法是进行银耳芽孢总蛋白提取的一种有效方法,可为银耳蛋白质生理功能的研究及银耳芽孢在食品加工中的应用奠定基础,同时也为其他食用菌总蛋白的提取提供参考。

[1] 彭彪, 戴维浩, 林雄平, 等. 6种木屑培养基对银耳菌种生长的影响[J]. 安徽农业科学, 2012, 40(19): 10052-10053. DOI:10.3969/ j.issn.0517-6611.2012.19.030.

[2] 徐文清, 高文远, 沈秀, 等. 银耳孢子多糖抑制肿瘤及放射增效作用的研究[J]. 中国生化药物杂志, 2006, 27(6): 351-354. DOI:10.3969/ j.issn.1005-1678.2006.06.010.

[3] 黄婧禹, 贾凤霞, 石文娟. 银耳多糖的研究进展[J]. 重庆中草药研究,2013(1): 43-47.

[4] LI H, LEE H S, KIM S H, et al. Antioxidant and anti-inflammatory activities of methanol extracts of Tremella fuciformis and its major phenolic acids[J]. Journal of Food Science, 2014, 79(4): C460-C468. DOI:10.1111/1750-3841.12393.

[5] CHA M H, HEO J Y, LEE C, et al. Quality and sensory characterization of white jelly mushroom (Tremella fuciformis)as a meat substitute in pork patty formulation[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 2014, 38(3): 1018-1023. DOI:10.1111/ jfpp.12503.

[6] TSENG Y H, YANG J H, LI R C, et al. Quality of bread supplemented with silver ear[J]. Journal of Food Quality, 2010, 33(1): 59-71. DOI:10.1111/j.1745-4557.2009.00288.x.

[7] ULZIIJARGAL E, YANG J H, LIN L Y, et al. Quality of bread supplemented with mushroom mycelia[J]. Food Chemistry, 2013,138(1): 70-76. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.10.051.

[8] HUNG C L, CHANG A J, KUO X K, et al. Molecular cloning and function characterization of a new macrophage-activating protein from Tremella fuciformis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014, 62(7): 1526-1535. DOI:10.1021/jf403835c.

[9] LAKSHMAN D K, NATARAJAN S S, LAKSHMAN S, et al. Optimized protein extraction methods for proteomic analysis of Rhizoctonia solani[J]. Mycologia, 2008, 100(6): 867-875. DOI:10.3852/08-065.

[10] 黄碧芳, 朱鸿萍, 李彩斌, 等. 虎奶菇菌丝体自溶蛋白质制备方法比较[J]. 中国食用菌, 2010, 29(1): 52-54. DOI:10.3969/ j.issn.1003-8310.2010.01.016.

[11] 刘靖宇. 草菇不同生长发育时期的比较蛋白质组学分析[D]. 福州:福建农林大学, 2012: 32-33.

[12] 刘晓云, 苏明声, 杨俊璋, 等. 灵芝子实体原基双向电泳和总蛋白质提取方法的建立[J]. 菌物学报, 2009, 28(6): 802-805.

[13] 郭丽琼, 刘二鲜, 王杰, 等. 高效银耳芽孢遗传转化体系的建立[J]. 中国农业科学, 2008, 41(11): 3728-3734. DOI:10.3864/ j.issn.0578-1752.2008.11.038.

[14] 孙淑静, 林喜强, 谢宝贵, 等. 银耳芽孢遗传多样性分析[J].热带作物学报, 2009, 30(9): 1308-1313. DOI:10.3969/ j.issn.1000-2561.2009.09.017.

[15] 陈美元, 王泽生, 廖剑华, 等. 双孢蘑菇基质降解能力退化的差异蛋白质组学分析[J]. 菌物学报, 2011, 30(3): 508-513.

[16] 赵洲. 光质对灵芝生理代谢的影响及其差异蛋白质组学研究[D]. 北京: 北京协和医学院, 2013: 59-60.

[17] BHADAURIA V, ZHAO W S, WANG L X, et al. Advances in fungal proteomics[J]. Microbiological Research, 2007, 162(3): 193-200. DOI:10.1016/j.micres.2007.03.001.

[18] 唐奕诗, 马楚莹, 周玉萍, 等. 一种高效的灵芝菌丝体总蛋白的提取方法[J]. 生物技术世界, 2014(10): 4-6.

[19] 黄桂英. 真姬菇低温胁迫下菌丝体酶活变化及差异蛋白质组学研究[D]. 福州: 福建农林大学, 2008: 20-21. DOI:10.7666/d.y1322820.

[20] WANG W, TAI F J, CHEN S N. Optimizing protein extraction from plant tissues for enhanced proteomics analysis[J]. Journal of Separation Science, 2008, 31(11): 2032-2039. DOI:10.1002/jssc.200800087.

[21] BRADFORD M M. Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of proteindye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1/2): 248-254. DOI:10.1016/0003-2697(76)90527-3.

[22] 田孟祥, 余本勋, 张时龙, 等. 蛋白质电泳中考马斯亮蓝R-250染色方法的优化与改进[J]. 河南农业科学, 2014, 43(9): 35-37. DOI:10.3969/j.issn.1004-3268.2014.09.008.

[23] 秦慧, 刘霆, 柳斌, 等. 几种双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较[J]. 中国实验血液学杂志, 2006, 14(1): 168-172. DOI:10.3969/ j.issn.1009-2137.2006.01.038.

[24] 张保青. 低温胁迫下甘蔗后期生理特性及差异蛋白质组学研究[D].南宁: 广西大学, 2013: 27-28. DOI:10.7666/d.Y2407550.

[25] KIM Y, NANDAKUMAR M P, MARTEN M R. Proteomics of filamentous fungi[J]. Trends in Biotechnology, 2007, 25(9): 395-400. DOI:10.1016/j.tibtech.2007.07.008.

[26] CHEN S X, HARMON A C. Advances in plant proteomics[J]. Acta Phytoecologica Sinica, 2006, 6(20): 5504-5516. DOI:10.1002/ pmic.200600143.

[27] ISOLA D, MARZBAN G, SELBMANN L, et al. Sample preparation and 2-DE procedure for protein expression profiling of black microcolonial fungi[J]. Fungal Biology, 2011, 115(10): 971-977. DOI:10.1016/j.funbio.2011.03.001.

Development of an Efficient Method for Total Protein Extraction from Yeast-Like Conidia of Tremella fuciformis

LIU Yang, ZHU Hanyu, XU Danyun, ZHANG Lijiao, MA Aimin*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In order to compare extraction efficiencies of total protein from the yeast-like conidia of Tremella fuciformis by Tris-saturated phenol method, trichloroacetic acid (TCA)-acetone precipitation method and their combination, the cells were disrupted by ultrasound and high-pressure homogenization, the efficiency of cell disruption was observed by microscope,protein content was determined by the Bradford method, and SDS-PAGE gel electrophoresis analysis was performed. The results showed that the efficiency of cell disruption by high pressure homogenization was better than that by ultrasound. The protein contents obtained by three extraction methods were 2.33, 1.26 and 1.02 mg/mL, respectively. The brightness and resolution of electrophoresis bands with traditional coomassie brilliant blue staining by Tris-saturated phenol method were better than those obtained by two other methods. Hence Tris-saturated phenol method can be considered as a feasible method for protein extraction from the yeast-like conidia of T. fuciformis.

Tremella fuciformis; yeast-like conidia; protein extraction method

10.7506/spkx1002-6630-201609007

TS201

A

1002-6630(2016)09-0035-05

刘洋, 朱涵予, 许丹云, 等. 银耳芽孢总蛋白提取方法的建立[J]. 食品科学, 2016, 37(9): 35-39. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201609007. http://www.spkx.net.cn

LIU Yang, ZHU Hanyu, XU Danyun, et al. Development of an efficient method for total protein extraction from yeastlike conidia of Tremella fuciformis[J]. Food Science, 2016, 37(9): 35-39. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201609007. http://www.spkx.net.cn

2015-07-28

国家自然科学基金面上项目(31572182;30972072)

刘洋(1991—),男,硕士研究生,研究方向为食品生物技术。E-mail:272222498@qq.com

*通信作者:马爱民(1965—),男,教授,博士,研究方向为食品生物技术。E-mail:aiminma@mail.hzau.edu.cn

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