SHP2介导IL-6促进乳腺癌细胞侵袭作用机制的研究*

杨毅 张洁 王智勇 张飞 牛瑞芳

·基础研究·

SHP2介导IL-6促进乳腺癌细胞侵袭作用机制的研究*

杨毅 张洁 王智勇 张飞 牛瑞芳

目的：探讨非受体型酪氨酸磷酸酶SHP2介导白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）促进人乳腺癌细胞侵袭的作用，以及相应的分子机制。方法：利用外源性重组IL-6处理人乳腺癌细胞T47D，采用表达IL-6的慢病毒感染T47D细胞使其内源性表达IL-6，观察细胞的形态学改变情况，分析细胞迁移和侵袭能力的变化。采用小RNA干扰的方法下调IL-6信号通路中关键分子SHP2的表达，观察其表达下降对IL-6促进乳腺癌细胞侵袭能力的影响，同时采用Western blot方法检测Erk1/2磷酸化变化。结果：上调IL-6在乳腺癌细胞中的表达显著促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，且细胞发生由上皮形态向类成纤维细胞形态的变化，同时伴随着上皮标志性蛋白E-cadherin表达下调和间质标志Vimentin表达上调。下调SHP2的表达明显抑制IL-6诱导乳腺癌细胞的上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）和侵袭能力，同时伴随着细胞内Erk1/2磷酸化水平的下降。结论：SHP2通过介导IL-6诱导的EMT促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。

SHP2 乳腺癌 侵袭 IL-6 上皮间质转化

乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤的首位，虽早期患者的10年生存率超过90%，但晚期乳腺癌患者的预后仍然较差［1］。转移是导致患者治疗失败和死亡的最主要原因。近年来的研究发现，白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）信号通路的激活与肿瘤进展的关系非常密切，如患者的肿瘤微环境中较高的IL-6水平与淋巴结和远处转移密切相关［2］，乳腺癌细胞中IL-6信号的激活能够促进细胞对赫赛汀发生耐药，而阻断该信号则可明显抑制肿瘤的生长和转移［3］。然而IL-6信号通路促进乳腺癌进展的详细机制目前尚不清楚，有必要进行深入研究。

具有SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶2（Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase2，SHP2）是第一个确定的具有酪氨酸磷酸酶活性的原癌基因［4］。有研究显示SHP2在多种肿瘤组织中高表达，抑制SHP2可以诱导乳腺癌细胞向正常乳腺上皮细胞形态转变［5］，下调SHP2的表达能够有效抑制肿瘤在小鼠体内的生长和转移［6］。这些结果表明SHP2在乳腺癌进展中起非常关键的作用，但相应分子机制的研究鲜见报道。本研究分析IL-6对乳腺癌细胞侵袭迁移的影响，同时采用分子和细胞生物学研究方法探讨SHP2在介导IL-6促进乳腺癌细胞发生上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）的作用机制，为进一步明确SHP2促进乳腺癌细胞侵袭转移的分子机制提供思路。

1 材料与方法

1.1材料

人胚肾上皮细胞株HEK-293T和人乳腺癌细胞系T47D、MDA-MB-231细胞购自美国ATCC细胞库，由本课题组保存。RPMI 1640细胞培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；Transwell小室购自美国Millipore公司；限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ购自美国NEB公司；IL-6 ELISA试剂盒购自深圳达科为公司；Matrigel基质胶和小鼠抗人E-cadherin单克隆抗体购自美国BD公司；兔抗人Erk1/2、p-Erk1/2、p-SHP2、Vimentin和Slug单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；小鼠抗人SHP2、β-actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1IL-6慢病毒表达载体的构建从IL-6阳性表达的MDA-MB-231细胞中提取总RNA，逆转录为cDNA后，以此为模板，采用PCR的方法扩增IL-6的编码区，上下游引物分别包含BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点。将纯化后的PCR产物用限制性内切酶酶切后，将其与采用同样双酶切后的慢病毒表达载体pCDH进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落扩增摇菌，提取质粒，进行双酶切和测序验证。

1.2.2慢病毒包装和感染将pCDH-IL-6载体与两个辅助包装质粒按照适当比例混合，采用基于Lipfectamine 2000的方法将其转染至HEK-293T细胞中，转染48和72 h后，收取培养液上清，离心去除细胞碎片，采用超滤离心的方法浓缩病毒。将慢病毒感染T47D细胞，感染48 h后，加入4 μg/mL的嘌呤霉素进行筛选，获得稳定表达IL-6的T47D细胞。

1.2.3siRNA转染实验转染前一天将T47D细胞接种至6孔板中，使细胞汇合度达到30%左右。第二天将10 μL对照siRNA和SHP2特异siRNA以及5 μL的转染试剂Lipfectamine 2000分别加入250 μL不含血清的培养液稀释，室温放置5 min后，将siRNA和转染试剂混合，放置20 min后将上述混合物加入至细胞中，6 h后更换为新鲜的细胞培养液。转染48 h后收取细胞验证转染效率。

1.2.4伤口愈合实验将细胞种植在6孔板中，待细胞达到100%汇合，采用10 μL移液器吸头在培养板底部划一条均匀的划痕，使用PBS洗去悬浮的细胞，然后更换为含有0.5%血清的培养基，在37℃孵箱中培养，分别在0、6、12、18和24 h观察记录细胞迁移的距离，并进行统计学分析。

1.2.5Transwell侵袭实验将20 μL Matrigel（按照1:4稀释）加入至Transwell小室的底部，将小室置于37℃孵箱中1 h使基质胶凝固。消化并收取细胞，使用无血清培养基重悬，调整细胞密度至1×105/mL，在小室上部加入200 μL细胞悬液，小室下槽加入600 μL含10%血清的培养基，将细胞置于37℃孵箱中培养，24 h后弃去上室中未穿过膜的细胞，将细胞固定、染色，显微镜下计数穿过膜的细胞数目，进行统计学分析。

1.2.6Western blot检测采用1×SDS细胞裂解液提取细胞总蛋白，进行蛋白定量后，按照40 μg/孔的上样量进行SDS-PAGE电泳分离，转印至PVDF膜上，采用5%脱脂奶粉在室温封闭1 h，加入相应的一抗，在4℃摇床中孵育过夜，使用TBST清洗3次后，加入HRP标记的二抗继续室温孵育1 h，使用TBST清洗3次后，加入ECL化学发光底物在暗室曝光显影。

1.3统计学分析

采用Graphpad Prism 6.0软件进行数据分析。组间差异分析采用t检验或者方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1外源性IL-6处理对乳腺癌细胞迁移能力的影响

Western blot结果显示，与未采用IL-6刺激的细胞对照组比较，外源性IL-6刺激组细胞中SHP2和Erk1/2的磷酸化水平显著升高（图1A）。伤口愈合实验的结果显示，在IL-6刺激后细胞的迁移能力明显升高（图1B），差异具有统计学意义（P＜0.01，图1C）。2.2稳定高表达IL-6的乳腺癌细胞系T47D-IL-6的构建

通过慢病毒感染和嘌呤霉素筛选，成功构建多株稳定表达IL-6的T47D细胞，命名为T47D-IL-6。PCR检测结果显示，T47D-IL-6细胞中IL-6的mRNA表达水平比仅表达空载体的对照组细胞增高了约100倍（图2A）。同时ELISA的结果显示，6孔板内培养上清中每孔细胞在12 h内检测分泌出约1 500 pg的IL-6蛋白（图2B）。

2.3上调IL-6的表达对乳腺癌细胞侵袭能力的影响

Western blot检测的结果显示，稳定表达IL-6后T47D细胞中Erk1/2和SHP2的磷酸化水平显著高于仅表达空载体的对照组细胞（图3A），这与外源性IL-6的作用结果相一致。同时上调IL-6的表达显著增强了乳腺癌细胞T47D的侵袭能力（图3B）。

2.4IL-6表达升高对乳腺癌细胞EMT发生的影响

与仅表达空载体的对照组细胞相比，高表达IL-6后细胞由上皮形态向类成纤维细胞形态转变（图4A），而且上皮标志性蛋白E-cadherin的表达水平显著降低，间质标志性蛋白Vimentin的表达轻微升高，EMT相关转录因子Slug的表达水平也明显增高（图4B）。这些结果表明IL-6增强乳腺癌细胞的侵袭能力与其促进细胞发生EMT有关。

2.5下调SHP2的表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

与转染对照siRNA的细胞相比，转染SHP2特异siRNA明显抑制了T47D细胞中SHP2的表达（图5A），同时伤口愈合实验和Transwell实验的结果也进一步证实下调SHP2的表达显著抑制了细胞的迁移和侵袭能力，差异具有统计学意义（P＜0.000 1，图5B、C）。

2.6下调SHP2的表达对IL-6诱导EMT和Erk1/2磷酸化的影响

下调SHP2的表达T47D细胞中Erk1/2的表达无明显变化，但Erk1/2磷酸化的表达水平显著下降（图6A）。同时发现IL-6作用72 h后，SHP2表达下调明显减弱细胞中E-cadherin的表达下降，提示SHP2在IL-6诱导乳腺癌细胞EMT过程中发挥关键作用（图6B）。

图1　IL-6对乳腺癌细胞迁移能力的影响Figure 1Effect of IL-6 on migration ability of breast cancer cells

图2　稳定高表达IL-6的乳腺癌细胞系建立Figure 2Establishment of IL-6 overexpressing stable T47D cells

图3　上调IL-6的表达对T47D细胞侵袭能力的影响Figure 3Effect of IL-6 upregulation on invasion ability of T47D cells

图4　IL-6表达增高对乳腺癌细胞EMT发生的影响Figure 4Effect of IL-6 overexpression on EMT of breast cancer cells

图5　下调SHP2的表达对乳腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响Figure 5Effect of SHP2 knockdown on migration and invasion ability of breast cancer cells

图6　下调SHP2对IL-6诱导乳腺癌细胞中Erk1/2磷酸化和E-cadherin表达的Western blot分析Figure 6Western blot analysis of IL-6-induced Erk1/2 phosphorylation and E-cadherin expression in SHP2 knockdown breast cancer cells

3 讨论

转移是导致癌症患者治疗失败和死亡的主要原因［7］，肿瘤转移是一个复杂的多步骤的过程。目前的研究表明，肿瘤微环境对肿瘤转移起着重要的促进作用，肿瘤微环境是由癌细胞、基质细胞以及这些细胞分泌的细胞因子、趋化因子等组成［8-9］。这些细胞因子和趋化因子可通过多种路径调节肿瘤的进展，如肿瘤微环境中的VEGF可促进肿瘤的血管形成，EGF、CXCL12可促进肿瘤的远处转移等。研究表明肿瘤微环境中IL-6的水平升高对乳腺癌的进展起非常关键的作用，如IL-6水平升高与患者的淋巴结和远处转移密切相关［2］、HER-2阳性的乳腺癌细胞可通过上调IL-6的水平并形成一个自分泌环从而促进肿瘤的进展［10］、激活的IL-6信号能够通过上调肿瘤干细胞的数量从而促进HER-2阳性细胞对赫赛汀发生耐药，阻断该信号则可明显抑制肿瘤的进展［3］。本研究发现，无论是外源性IL-6或是肿瘤细胞内源性表达的IL-6均能够明显促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，并证实了IL-6在促进乳腺癌进展方面发挥的重要作用，为深入研究IL-6促进肿瘤细胞侵袭转移的分子机制，建立了IL-6稳定过表达乳腺癌细胞系的理想研究模型。

EMT在肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用［11］。当细胞发生EMT后，由于维持上皮表型的关键分子E-cadherin的功能丢失，使得细胞与细胞之间黏附能力降低，上皮表型丧失，随之获得间质细胞特性，迁移能力增强。癌细胞发生EMT后可促进细胞外基质的降解，促进肿瘤细胞向周围组织浸润，以及侵入血管发生远处转移等。本研究发现IL-6表达上调以后，乳腺癌细胞形态上发生类成纤维细胞样改变，E-cadherin丢失，而且伴随着侵袭能力的显著增强，表明IL-6促进乳腺癌细胞的侵袭迁移是通过诱导细胞发生EMT而实现，与IL-6和癌蛋白YB-1能够相互作用促进乳腺癌转移的研究结论相一致［12］。因此，明确IL-6信号通路促进乳腺癌转移的详细机制，发现介导乳腺癌转移的关键分子将有助于筛选新的用于乳腺癌治疗的分子靶点［2］。

酪氨酸磷酸酶SHP2在多种肿瘤组织中高表达，与大多数磷酸酶抑癌作用所不同的是SHP2为一种促进肿瘤发生和进展的癌基因［13-14］。SHP2的这种作用与其能够介导MAPK信号通路的激活密切相关［13］。本研究发现，IL-6促进肿瘤细胞侵袭能力增强的同时伴随着SHP2和Erk1/2磷酸化水平的增高，提示SHP2可能与IL-6促进乳腺癌细胞侵袭能力增强有关。下调SHP2的表达显著抑制了乳腺癌细胞的侵袭能力，同时导致细胞中Erk1/2的磷酸化水平也显著下降。进一步的研究证实SHP2表达下调亦抑制了细胞中E-cadherin的表达降下，提示细胞的EMT过程受到抑制，与最近在前列腺癌中的SHP2能够通过增强EMT促进前列腺癌转移的研究相一致［15］。以上结果表明SHP2是介导肿瘤细胞发生EMT的关键分子。

综上所述，本研究发现IL-6信号通路的激活能够促进乳腺癌细胞的侵袭能力，这个过程是通过诱导细胞的EMT而实现。此外，还证实酪氨酸磷酸酶SHP2位于IL-6的下游介导了这个过程。

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（2016-06-24收稿）

（2016-08-31修回）

杨毅专业方向为恶性肿瘤侵袭转移的分子机制等研究。

E-mail：yiyang@tmu.edu.cn

SHP2 mediates IL-6-induced enhancement of breast cancer cell invasiveness

Yi YANG，Jie ZHANG，Zhiyong WANG，Fei ZHANG，Ruifang NIU
Correspondence to:Ruifang NIU；E-mail:niuruifang@tjmuch.com

Public Laboratory，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy of the Ministry of Education，Tianjin 300060，China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81372844）

Objective:To investigate the effect of non-receptor protein tyrosine phosphatase，SHP2，on the regulation of IL-6-induced invasiveness of breast cancer cells as well as its molecular mechanism.Methods:Human breast cancer cells，T47D，were treated with exogenous IL-6 or infected with IL-6-expressing lentivirus.Changes in cell morphology were observed，and cell migration and invasion ability were analyzed.Small interference RNA method was used to downregulate the expression of SHP2，a key molecule in IL-6 pathway.Wound healing and Transwell methods were used to investigate the effect of SHP2 knockdown on cell migration and invasion，and Western blot method was used to examine the changes of Erk1/2 phosphorylation.Results:Upregulation of IL-6 significantly enhances migration and invasion of breast cancer cells.IL-6 induced a significant morphological switch from the epithelial phenotype to the mesenchymal fibroblast phenotype，downregulation of the epithelial marker E-cadherin，and upregulation of mesenchymal marker vimentin.Knockdown of SHP2 inhibited IL-6-induced epithelial mesenchymal transition and invasiveness.Phosphorylation of Erk1/2 also decreased in SHP2-silencing cells.Conclusion:SHP2 mediates IL-6-induced epithelial to mesenchymal transition and promotes invasiveness of breast cancer cells.

SHP2，breast cancer，invasion，IL-6，epithelialmesenchymal transition

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.18.744

天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所公共实验室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，教育部乳腺癌防治重点实验室（天津市300060）

*本文课题受国家自然科学基金面上项目（编号：81372844）资助

牛瑞芳niuruifang@tjmuch.com