慢性应激对大鼠行为学及脑神经颗粒素水平的影响及药物防治

徐天勇，李仲铭，刘　锐,　张　祥,　范　艳,　胡月新



慢性应激对大鼠行为学及脑神经颗粒素水平的影响及药物防治

徐天勇1，李仲铭2，刘锐3,张祥2,范艳2,胡月新1

目的探讨慢性应激对大鼠外显行为学变化的影响，检测体内儿茶酚胺类物质及神经颗粒素(Neurogranin，Ng)表达的变化及三七皂苷Rg1的防治效果。方法成年雄性SD大鼠36只，随机分为对照组(CON)、模型组(CUS)、和治疗组(CUS-G)，采用慢性不可预见性应激方法建立慢性应激动物模型；采用旷场试验检测行为学变化，运用Morris水迷宫实验进行学习记忆力测试，使用放射免疫法检测血浆、脑组织儿茶酚胺类含量，Western blot法检测皮质、海马、下丘脑Ng含量。结果6 w慢性应激后，实验组大鼠在水平运动和垂直运动方面得分均明显低于对照组与药物组，均P<0.05；水迷宫实验显示慢性应激后动物逃避潜伏期明显延长，而治疗组大鼠逃避潜伏期呈下降趋势(P<0.05)；血浆、脑组织去甲肾上腺素与多巴胺在对照组、实验组与药物组间无明显变化；慢性应激大鼠皮质、海马、下丘脑Ng含量水平皆与模型大鼠有差异(P<0.05、P<0.01、P<0.05)，治疗大鼠皮质、海马、下丘脑Ng含量亦皆与模型大鼠有差异(P<0.01、P<0.05、P<0.05)。结论慢性应激研究领域，神经颗粒素的敏感性优于单胺类神经递质，可作为敏感指标加以观察；100 mg/kg剂量的三七皂苷Rg1能够抑制应激所致学习记忆功能紊乱，对应激所致外显行为有积极的调节作用，对脑内神经颗粒素表达水平降低趋势有较好抑制作用。

慢性不可预见性应激；学习记忆；儿茶酚胺类物质；神经颗粒素；三七皂苷Rg1

传统应激理论认为过度应激使脑组织儿茶酚胺类神经递质耗损，进而引起情绪、认知行为异常表现[1],近些年研究发现脑认知功能区域特异性蛋白-神经颗粒素亦在学习记忆、神经发育方面扮演重要角色[2,3]。本实验拟探讨慢性应激对大鼠学习记忆功能的影响及在此过程中儿茶酚胺类神经递质、Ng表达的变化，观察三七皂苷Rg1对应激模型大鼠脑组织儿茶酚胺类神经递质、Ng表达的影响，为应激综合征的临床防治及新药开发提供理论依据。

1　材料与方法

1.1主要试剂及仪器Morris水迷宫(北京杰日欧公司提供)；三七皂苷Rg1：白色晶状粉末物质，昆明制药厂提供，纯度>98.57%；儿茶酚胺放射免疫测定盒(天津协和医药科技有限公司代理，美国DIASOURCE公司)；GC-2016γ放射免疫计数仪(美国PICKER公司)；兔抗大鼠Ng抗体(Abcam公司)，山羊抗兔IgG辣根酶标记(北京中杉金桥生物技术有限公司)，β-actin 单克隆抗体(美国Sigma公司)；Ge1.Doc凝胶成像半定量分析系统购自Bio-Rad公司。

1.2实验动物及分组

1.2.1实验动物成年健康雄性SD大鼠36只(体重200±5 g，昆明医科大学实验动物中心提供，符合GB/T14925-94标准)。适应性饲养1 w后,按随机数字表法分为以下3组：对照组(CON)、慢性不可预见性应激试验组(CUS)、药物治疗组(CUS-G)，每组12只。

1.2.2造模及给药方法采用以下应激源:行为限制(2 h)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、食物剥夺(12 h)、饮水剥夺(12 h)合并空瓶刺激、明暗颠倒(12 h)、湿笼(12 h)、倾斜(45 ℃,12 h)刺激动物。实验持续6 w，每天随机抽取两种应激源作用于大鼠，使之无法预知何种刺激将要发生[1]。对照组饲养于同一环境，合笼饲养且无应激源刺激，每次复制模型前1 h给3组大鼠灌胃，对照组、慢性不可预见性应激组予以生理盐水，药物治疗组予以三七皂苷Rg1100 mg/kg，药物溶于纯化水，灌胃容积均为0.6 ml/只[4,5]。

1.3行为学检测

1.3.1旷场试验装置为36 cm×36 cm×36 cm无顶纸箱，箱底用墨线分成9个等分方格，将大鼠置于中央方格内，观察30 s内活动情况。统计方法：动物1/2以上身体从所在方格进入相邻方格计1分，大鼠后肢直立计1分[1]。

1.3.2Morris水迷宫实验实验前、模型期结束后分别对大鼠进行用Morris水迷宫测定大鼠空间学习记忆的能力。在水池上标定相同一点作为每次实验入水点，站台置于离入水点较远的象限的中间，实验采用预先训练两次，将动物从相同入水点放入，每次训练2 min的方案，若动物在2 min 内找到平台，并在其上停留3 s为合格者，记录其找到平台的时间作为逃避潜伏期，若动物2 min内未找到平台，将动物放到平台上使之停留3 s，其逃避潜伏期记为120 s，记录第3次的数据作为评价标准[1]。

1.4标本制备模型期结束后用10%水合氯醛腹腔内注射麻醉后固定于手术台，剪开胸腔，暴露心脏，用5 ml注射器针头插入左心室，采血5 ml放入抗凝管中,3000 r/min离心10 min,取血清-20 ℃保存,待测。采血后立即灌注生理盐水，待右心耳膨起，剪开右心耳让血液流出，至右心耳流出液为无色透明，冰浴环境下剖颅分离皮质、海马[5]。

1.5脑组织制备冰浴环境下剖颅分离的脑组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入2 ml PE管内；用移液管量取9倍于组织块重量预冷的0.86%冷生理盐水(用0.9%生理盐水进行调配)于PE管中，用眼科小剪尽快剪碎组织块；超声粉碎(振幅12.7 mm，30 s),将制备好的10%匀浆用低温低速离心机3000 r/min左右，离心10 min，离心好的匀浆留上清弃沉淀[5]。

1.6血浆、脑组织儿茶酚胺类物质检测按放免诊断药盒说明操作,用GC-1200γ计数放免仪检测血液、脑组织儿茶酚胺含量。

1.7蛋白免疫印迹检测Ng表达冰浴环境下剖颅分离的皮质、海马组织，液氮速冻后研磨成粉状，分别取50 mg皮质、海马组织，加入750 μl RIPA buffer，冰浴下匀浆，4 ℃，12000 rpm离心30 min，取上清进行BCA法蛋白浓度测定。取样本加入上样缓冲液后进行电泳，转至PVDF膜，以封闭液封闭2 h后加入一抗(1∶800)，4 ℃摇晃孵育过夜，TPBS漂洗3次，每次15 min，加入羊抗兔IgG抗体(1∶3000)，室温孵育2 h；TPBS漂洗3次/15 min。将PVDF膜上加入ECL发光液，待反应1 min后，放入胶片、显影、定影，胶片经Bio-Rad胶片扫描系统扫描后，Ge1.Doc凝胶成像分析软件分析，蛋白表达水平以Ng光密度值与对应内参β-actin光密度值比值表示，单位为光密度单位(Optical Density Unit，ODU)[6]。

2　结　果

2.1慢性不可预见性应激对大鼠旷场作业的影响实验前各组大鼠在单位时间内在水平运动、垂直运动得分无差异，6 w慢性应激后实验组大鼠在水平运动和垂直运动方面得分与对照组、药物组呈现明显差异，均P<0.05(见图1、图2)。

2.2学习记忆变化(水迷宫实验)实验前对大鼠进行水迷宫测试，结果表明各组动物逃避潜伏期无明显差异；实验开始3 w后对照组、药物组动物水迷宫测试逃避潜伏期呈现不同程度缩短并持续到第6周，实验组逃避潜伏期在第3周已显现延长趋势并持续到第6周，并在第3周、第6周分别与对照组、药物组形成较大差异(见表1)。

2.3血浆儿茶酚胺含量的变化及药物干预作用6 w慢性应激后，实验组血浆多巴胺和去甲肾上腺素均有不同程度的升高，但与空白组、药物组尚无明显差异,均P>0.05(见表2)。

2.4脑组织儿茶酚胺含量的变化及药物干预作用6 w慢性应激后，实验组大鼠脑组织多巴胺有升高趋势，去甲肾上腺素则呈下降趋势，但不同趋势与空白组、实验组均无统计学意义,均P>0.05(见表3)。

2.5慢性应激对大鼠脑组织Ng蛋白质表达的影响通过Western-blotting分析发现，6 w应激后，大鼠皮质、海马、下丘脑神经颗粒素蛋白带的平均光密度值(IOD)均有不成程度改变：皮质实验组神经颗粒素蛋白表达显著降低，并与空白组、药物组形成显著性差异，均P<0.01；海马实验组神经颗粒素蛋白表达显著降低，并与空白组、药物组形成明显、显著性差异，P<0.05/P<0.01；下丘脑实验组神经颗粒素蛋白表达亦降低，但与空白组尚未形成明显差异，可能与时间点尚未到达有关，而实验组与药物组形成则明显差异，P<0.05。上述结果表明慢性应激使得神经颗粒素蛋白在皮质、海马和下丘脑中的表达均成降低趋势，使用三七皂甙后能改变蛋白表达降低趋势(见表4)。

表1　各组小鼠4 w 5次水迷宫测试成绩比较　(单位

与CON组比较#P<0.01；与CUS组比较*P<0.05,**P<0.01

组别例数DANECONCUSCUS⁃G12121251．47±2．3458．36±5．753．64±3．4392．06±6．12101．11±10．599．93±3．79

组别例数DANECONCUSCUS⁃G1212127．31±1．488．49±1．677．52±1．821．06±0．120．97±0．101．05±0．12

表4　Western blot法检测各组大鼠脑组织Ng蛋白表达影响　(单位

与CON组比较#P<0.05,##P<0.01；与CUS组比较*P<0.05,**P<0.05

与CON组比较#P<0.05；与CUS组比较*P<0.05

3　讨　论

本次研究采用诸多不可预见性刺激因子模拟日常持续性低强度生活事件以最大程度模拟由各种长时程、低强度、适应不良等各类生活事件所引起的慢性应激状态，与高强度刺激因素相比,此模型躯体应激因素较小，能更好地突出心理或情绪因素，是一种较好的负性心理应激动物模型[1，7]。

旷场试验结果表明实验前各组大鼠在新异环境中的探究行为和对新环境的警觉性并未有差异，因而其水平运动与垂直运动得分并未有异常表现，随着应激时程延长，应激大鼠水平、垂直活动次数减少，在原格停留时间延长，上述改变表明应激大鼠的活动度降低，对新鲜环境的好奇程度降低，动物的绝望和行为退缩行为增强，行为表现由初始的兴奋状态过渡到抑制状态。此外，应激开始前预防性给予三七皂苷Rg1直至应激结束，则能改善大鼠在旷场试验中的表现，即水平运动与垂直运动得分比实验组大鼠增加，差异有统计学意义(P<0.05)，表明三七皂苷Rg1能改善由慢性应激引起的体力下降、兴趣缺乏及活动迟滞，减轻了动物自身的疲劳感，使机体保持一定的兴奋性，不同程度地逆转模型大鼠的“躯体疲劳”和“心理疲劳”，使其体力恢复、活动增加。

较多研究资料证实，应激因素作用于机体时，通过多种通路引起神经递质、信号转导以及突触可塑性等方面的改变，从而影响机体学习记忆功能[8～10]。因此，对学习记忆力能力的评估亦为评价慢性应激程度的主要检测方法。本研究运用Morris水迷宫实验对大鼠空间觅向能力和空间学习记忆能力进行检测，发现慢性应激后大鼠空间记忆能力明显受损，即应激大鼠逃避潜伏期明显延长，提示慢性束缚应激可导致实验动物对已储存记忆的读出或提取过程产生负面影响。应激前预防性给予三七皂苷Rg1直至应激结束，应激期后水迷宫实验结果显示大鼠在Morris水迷宫测试中的成绩有明显改善，差异有统计学意义(P<0.05)，而认知行为是脑力作用的表现形式之一，表明三七皂苷Rg1能改善应激所致的学习记忆功能的损伤。

慢性应激与学习记忆间关系的研究，既往研究主要集中在脑组织单胺类神经递质与学习记忆关系方面。脑组织茶酚胺类神经递质在中枢神经系统中参与机体觉醒、注意力和学习记忆功能的调节。先前本课题组研究发现慢性应激导致动物脑组织儿茶酚胺类神经递质减少，动物学习记忆能力降低的外显行为学表现亦有明显改变，上述变化与应激致脑组织对儿茶酚胺类(Catecholamines,CA)神经递质的消耗增加，而外周CA又因肝酪氨酸氨基转化酶活性增高而分解加速，影响CA合成前体物质的转运有关[11～13]。

在本次研究中，动物历经6 w慢性应激后，实验动物脑组织多巴胺和去甲肾上腺素等CA类神经递质的消耗与非应激动物相比并未有明显变化，P>0.05，进而又对血浆CA进行检测，实验动物血浆多巴胺和去甲肾上腺素等CA类物质的含量与非应激动物相比并未有明显变化，P>0.05，预防性给予三七皂苷Rg1并未使血浆、脑组织CA有明显改变，P>0.05，上述实验结果与之前研究结果有明显差异(既往诸多研究结果提示慢性应激致使动物血浆/脑组织多巴胺和去甲肾上腺素等CA类物质含量发生变化)，提示学习记忆减退并非由单一因素决定，尚有其余神经相关物质参与应激反应调节[1]。

皮质、海马、下丘脑作为学习记忆及认知活动的重要脑区，其内部必然有除DA、NE以外与学习记忆功能密切相关的功能性物质和结构存在；否则，学习记忆的电生理活动无法引起神经系统形态学变化和功能新变化[14～16]。研究发现在皮质、海马、下丘脑的区域神经元胞体、树突和树突棘间内部存有由78个氨基酸组成的高密度神经元突触后膜蛋白-神经颗粒素，深入研究表明神经颗粒素作为蛋白激酶C的天然作用底物和钙调蛋白CaM的结合蛋白，参与神经元的突触形成、分化，而后者在学习能力的高低及记忆持久性方面扮演重要角色[17～20]。

本次研究发现慢性应激致使皮质、海马、下丘脑神经元细胞Ng蛋白含量下降，进而致使神经元细胞数量减少伴突棘数量减少，突触可塑性的损害造成大鼠水迷宫实验潜伏期延长，外显为学习记忆能力的降低。使用三七皂苷Rg1后Ng蛋白含量明显升高，甚至略高于对照组，提示三七皂苷Rg1具有对抗慢性应激所致Ng蛋白含量下降之积极作用，而Ng蛋白含量的升高促使皮质、海马、下丘脑细胞和/或树突棘结构的数量随之上升，进而促进突触可塑性及突触传递效能增强，使得学习记忆功能得以提高。但三七皂苷Rg1如何上调Ng蛋白含量的机制尚需进一步研究。

总之，本研究发现慢性应激可致动物出现不同程度的行为学变化，而应激动物血液和脑组织中儿茶酚胺类神经递质并未出现大幅度变化，甚至变化趋势亦未有之，提示传统儿茶酚胺类神经递质理论并非影响学习记忆之唯一因素；而定位于皮质、海马、下丘脑内部的神经元特异性蛋白质NG却产生明显变化，故而在学习记忆的研究领域，神经颗粒素的敏感性优于单胺类神经递质，在今后的研究中可将其作为敏感指标加以观察。此外，本研究尚发现100 mg/kg剂量的三七皂苷Rg1能够抑制应激所致学习记忆功能紊乱，对应激所致外显行为有积极的调节作用，对脑内神经颗粒素表达水平降低趋势有较好的上调作用。

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Research of ginsensode Rg1 on the expression of neurogranin in chronic unpredictable stress model rats

XUTianyong,LIZhongming,LIURui,etal.

(ExperimentCenterforMedicalScienceResearch,KunmingMedicalCollege,Kunming650031,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Ginsensode Rg1 on the expression of Neurogranin (Ng) in cortex,hippocampus and hypothalamus of rats with chronic stress model.Methods36 adult male SD rats were randomly divided into control group (CON),model group (CUS),and treatment group (CUS-G).The chronic stress model was established by chronic unpredictable stress.The morris water maze was used to study the memory test.The expressions of DA and NE were detected by using radioimmunoassay.The content of Ng in cortex,hippocampus and hypothalamus was detected by Western blot.ResultsThe water maze test showed that animal learning and memory ability decreased significantly after chronic stress,while the treatment group rats escape latency was significantly reduced,P<0.05；compared with control group，the content of DA and NE did not decrease significantly in model group (P>0.05).After 6 weeks of stress,rat cerebral cortex,hippocampus,hypothalamus Ng levels with chronic stress were significantly decreased compared with the model rats (P<0.05,P<0.01,P<0.05 respectively),the content of Ng content in cerebral cortex,hippocampus,hypothalamus were significantly increased with the model rat (P<0.01,P<0.05,P<0.05 respectively).ConclusionsIn chronic stress field,Ng is more sensitive than the monoamine neurotransmitters,it can be used as sensitive indicators to be observed.Chronic stress could change the behaviors of mice observably and the contents of Ng,the supplement of Ginsensode Rg1(100 mg/kg)could come into being some interference effects.

Chronic stress;Learning/memory；Atecholamines：Neurogranin；Ginsensode Rg1

1003-2754(2016)04-0311-05

2015-12-15；

2016-01-29

2012年云南省教育厅科学研究基金(2012C005);2014年国家自然科学基金(81460192)

(1.昆明医科大学科研实验中心,云南 昆明 650031;2.昆明医科大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系,云南 昆明 650031;3.昆明医科大学基础医学院实验中心，云南 昆明 650031)

胡月新,E-mail:hyxjx@sina.cn

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