姜黄素通过IGF-1/Akt/FoxO3a通路保护多巴胺能神经元细胞

郑世茹，白宏英，程宝仓



姜黄素通过IGF-1/Akt/FoxO3a通路保护多巴胺能神经元细胞

郑世茹，白宏英，程宝仓

目的观察姜黄素对鱼藤酮致帕金森(PD)大鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用及其机制。方法清洁级(SPF)雄性SD大鼠80只，随机分为溶剂对照组(空白组)、姜黄素对照组(对照组)、鱼藤酮模型组(模型组)、姜黄素治疗组(治疗组)，每组20只。空白组和对照组颈、背部皮下注射葵花油，其余两组在相同部位注射鱼藤酮建立帕金森模型，连续28 d，造模后观察各组大鼠行为学改变并评分。此后对照组和治疗组每天给予姜黄素灌胃，其余两组等量二甲基亚砜灌胃，连续28 d，后将大鼠全部处死。采用原位杂交、免疫印迹(Western blot)法检测黑质部IGF-1、Akt、FoxO3a的表达，采用免疫组化染色法检测黑质部酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞数。结果模型组大鼠TH、IGF-1、磷酸化的Akt(p-Akt)、磷酸化的FoxO3a(p-FoxO3a)表达较空白组和姜黄素组显著降低(P<0.05)；姜黄素治疗组TH、IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a表达高于模型组(P<0.05)。结论姜黄素可抑制帕金森大鼠多巴胺能神经元凋亡，其抗凋亡机制可能与激活IGF-1/Akt/FoxO3a通路有关。

帕金森病；鱼藤酮；细胞凋亡；姜黄素

近来研究发现鱼藤酮可透过血脑屏障并抑制脑组织线粒体复合物Ⅰ的活性，使呼吸链功能缺陷、能量生成障碍引起细胞内环境紊乱以及引发脂质过氧化和大量自由基的产生、细胞内钙超载，最终引起细胞凋亡，导致多巴胺能神经元变性缺失从而出现PD症状[1，2]。当Akt途径被抑制时，FoxO3a去磷酸化，在细胞核内大量表达，调节不同的凋亡靶目标，导致细胞凋亡；而PI3K-Akt通路激活后，FoxO3a磷酸化，核内表达减少，神经细胞凋亡减少，表明FoxO3a的磷酸化受PI3K-Akt通路调节。IGF-1是该信号通路的上游调节因子[3,4]。目前国内外文献对此信号通路在帕金森病中的研究较为少见。作者在建立鱼藤酮致帕金森大鼠模型的基础上通过观察大鼠中脑黑质类胰岛素一号增长因子(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、磷酸化的蛋白激酶B(PKB、又称Akt)、磷酸化的FoxO3a(一种Forkhead转录因子O亚家族的同源蛋白)表达水平以及中脑黑质区酪氨酸羟化酶(throsine hydroxylase,TH)阳性细胞数的变化，并应用姜黄素干预后对其表达的影响，探讨姜黄素可能的发挥多巴胺能神经元保护作用的分子机制。

1　材料与方法

1.1实验动物及试剂清洁级健康雄性SD大鼠80只，体质量(200～220)g[山西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(晋)20150001]。室温(2 5±2) ℃饲养，自然光照。鱼藤酮、姜黄素均购自美国 Sigma 公司，兔抗鼠IGF-1抗体、p-AKT抗体、p-Foxo3a抗体和TH抗体均购自美国Santa cruz公司。

1.2模型制备方法所有实验动物适应性饲养5 d确认无异常后，80只随机分为4组：空白组、对照组、模型组、治疗组，每组20只。模型组与治疗组大鼠采用颈背部皮下注射鱼藤酮法(将1.5 mg/kg溶解于葵花油，浓度1.5 mg/ml)制备模型，1次/d，连续注射28 d[5]。空白组及对照组造模方法同模型组，但只单纯注射等量葵花油。在造模28 d后的同一时间点，观察大鼠异常形态及行为，并参照Chen[6]等的评分标准评分。行为学评分2分以上为造模成功，最后每组均以酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫组化法作组织学鉴定。对照组及治疗组在造模成功24 h后予姜黄素(40 mg/kg/d)灌胃治疗，1次/天，连续治疗28 d。空白组与模型组同步每日等量二甲基亚砜灌胃，28 d后将大鼠全部处死。

1.3酪氨酸羟化酶免疫组化染色在最后1 d实验结束24 h后，10%水合氯醛(35 mg/100 g体质量)大鼠腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心脏灌注内固定，取脑，在冰盘上分离出中脑黑质；石蜡包埋切片，脱蜡、水化、抗原修复，PBS反复冲洗，加入封闭血清、一抗(1∶200)，4 ℃过夜；PBS冲洗，加二抗，PBS冲洗，滴加链霉卵白液，PBS冲洗，3-氨基-9-乙基卡唑(AEC)显色，苏木精染色，脱水，中性树胶封片。阴性对照：以正常兔血清代替一抗。正常脑组织与鱼藤酮损伤后脑组织对比后再次验证了造模成功。

1.4免疫印迹(Western blot)检测在最后1 d实验结束24 h后，大鼠给予10%水合氯醛(35 mg/100 g体质量)腹腔注射麻醉，取脑，生理盐水冲洗，在冰盘上快速分离出中脑黑质，-80 ℃保存。将脑组织剪碎，放于匀浆器中，加入蛋白裂解液，冰水匀浆裂解1 min，裂解液14000 r/min离心5 min；吸取上清液稀释，加入缓冲液，混匀后在沸水浴中煮沸5 min。聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，分别加入IGF-1(1∶1000)、p-Akt(1∶1000)、p-FoxO3a(1∶1000)抗体，4 ℃摇床低速摇动过夜孵育，缓冲液洗涤，加二抗(1∶4000)，37 ℃恒温摇床上，低速摇动孵育45 min，缓冲液洗涤，ECL显色，图像分析。

2　结　果

2.1大鼠中脑黑质区IGF-1、Akt、FoxO3a的表达变化Western blot法检测大鼠中脑黑质IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a的结果显示，模型组IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a的表达较空白组和对照组均显著降低(P<0.05);治疗组IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a的表达较模型组均显著升高(P<0.05)(见表1、图1)。

2.2大鼠中脑黑质区阳性细胞数变化 免疫组化染色结果显示，与空白组和姜黄素组相比，模型组大鼠中脑黑质区TH阳性细胞数显著减少；经姜黄素治疗后，与模型组相比，治疗组大鼠中脑黑质区TH阳性细胞数显著增加(见表2、图2)。

表1　各组大鼠黑质区IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a的表达

与空白组、对照组比较*P<0.05；与模型组比较#P<0.05

表2　各组大鼠黑质区TH阳性细胞数变化±s)

与空白组、对照组比较*P<0.05；与模型组比较#P<0.05

1：空白组2：对照组3：模型组4：治疗组

图1Western-blot法测定各组大鼠黑质区IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a表达情况

A：空白组；B组：对照组　C组：模型组；D组：治疗组

3　讨　论

目前对PD病因和病理机制的认识在不断深入，主要涉及遗传因素、免疫炎症反应、α-突触核蛋白的集聚、氧化应激学说、钙失衡、线粒体功能障碍、兴奋性氨基酸学说和细胞凋亡等。研究证据显示，神经毒性损毁作用在导致DA能神经元损伤中，细胞凋亡是重要形式[7，8]，凋亡蛋白caspase的激活是中脑黑质DA能神经元丢失的早期信号[9]。

PI3K/Akt通路是介导细胞存活的一条经典通路[10]。IGF-1可激动PI3K/Akt通路，活化的PI3K通过3-磷酰化磷酸肌醇酯和磷酸肌醇依赖性激酶(PDK)共同作用而激活Akt,活化的Akt可进一步激动促存活因子的转录从而抑制凋亡。研究发现，激活PKA和MAPK信号转导通路，可以对DA能神经元凋亡产生有效的抑制作用；另一基因产物P13K/PKB信号转导通路的磷酸化AKT水平保持持续稳定，则明显增加DA能神经元的细胞活性[11,12]。FoxO3a是PI3K-Akt信号通路重要的下游转录因子，磷酸化的PI3K激活Akt，Akt直接磷酸化FoxO3a，使其与胞核内结构蛋白特异性结合，由细胞核转运至细胞质，其介导的促凋亡过程得到抑制，从而促进细胞存活。

大量的研究证明,姜黄素具有抗氧化、抗炎、降血脂、抗肿瘤、以及对神经系统等多方面药理作用，还因其具有多靶点作用途经以及毒性低、安全性好、不良反应小、药源广、价格低廉等潜在优势，受到越来越多地重视。姜黄素可通过Bax/Bcl-2、NF-κB、ICAM-1、p38MAPK、JNK/SAPK和ERK1/2信号转导通路等多种机制，调节中枢神经系统内多种信号级联，发挥神经元细胞保护作用；但姜黄素是否能够通过激活IGF-1/Akt/FoxO3a通路，最终减少DA能神经元的变性丢失，报道较少。

本实验结果显示，环境毒素鱼藤酮在损伤黑质多巴胺能神经元的同时，抑制了大鼠黑质细胞P13K/PKB信号转导途径中的IGF-1、Akt、FoxO3a等多个关键分子的表达，并使酪氨酸羟化酶阳性细胞数显著减少，提示IGF-1/Akt/FoxO3a信号通路转导异常可能介导了模型大鼠黑质多巴胺能神经元的变性死亡；而姜黄素治疗能增强模型大鼠黑质细胞P13K/PKB信号转导通路中的IGF-1、Akt、FoxO3a的表达，并能减少模型大鼠黑质多巴胺能神经元数量的丢失；提示姜黄素可保持P13K/PKB信号转导通路的磷酸化AKT水平持续稳定，明显增加DA能神经元的细胞活性，抑制DA能神经元变性死亡。帕金森病是在多因素交互作用下通过线粒体功能障碍、细胞凋亡等多种机制最终导致DA神经元细胞的大量变性丢失。本研究以抑制细胞凋亡为切入点，探讨姜黄素对DA神经元细胞的保护作用及作用机制，为姜黄素对帕金森病的治疗研究以及如何提高中脑黑质IGF-1、Akt、FoxO3a的表达治疗帕金森病提供了新的思路与途径。

综上所述,本研究结果表明姜黄素可对多巴胺能神经元细胞起保护作用，干预PD的发生和发展，其作用机制可能与其能提高黑质部IGF-1、Akt、FoxO3a的表达水平，通过该信号通路调控细胞凋亡参与组织细胞的发生和修复，减少多巴胺能神经元的变性丢失有关。然而,姜黄素如何通过IGF-1/Akt/FoxO3a信号转导通路调控细胞凋亡还需要深入的研究证实。

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Curcumin prevents dopaminergic neurons through IGF-1/Akt/FoxO3a singaling pathway

ZHENGShiru，BAIHongying，CHENGBaocang.

(DepartmentofNeurology,TheSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China)

ObjectiveTo observe the protecetive effect of curcumin on substantia nigra dopaminergic neurons of rotenone-induced Parkinsin’s disease(PD) in SD rats and study their possible mechanism.Methods80 male SD mice under SPF condition with average body weight of 210 g were randomly allocated to four groups(n=20,each) of solvent control group(blank group)，curcumin control group(control group),rotenone-induced PD group(PD group)and curcumin treatment group(treatment group).Curcumin (1.5 mg/kg) (versus 1 ml sun-flower oil in blank group and control group) were subcutaneously injected in neck-back skin in PD group and treatment group in order to establish the model of PD.The preparation of model was given once day for continuous 28 days.After the model establishment,the ethology changes were observed and scored.Subsequently,the rats in control group and treatment group received daily curcumin(40 mg/kg) (versus same volume dimethyl sulfoxide in blank group and PD group) orally.The treatment was given once a day for continuous 28 days.All rats in four groups were sacrificed on 29th day.Their brain tissues were taken and tested.The expressions of IGF-1,Akt and FoxO3a proteins in substantia nigra tissues were measured by Western blotting.The changes of tyrosine hydroxylase (TH) positive cells in the substantia nigras were evaluated by immunohistochemical staining.ResultsThe expressions of TH,IGF-1,p-Akt and p-FoxO3a in substantia nigra tissues were significantly lower in model group than in blank group and control group(bothP<0.05).The expressions of TH,IGF-1,p-Akt and p-FoxO3a in substantia nigra tissues were significantly higher in treatment group than in model group (bothP<0.05).ConclusionsCrcumin can inhibit rotenone-induced apoptosis of dopaminergic neurons in rats．The anti-apoptotic mechanism might be associated with activation of IGF-1/Akt/FoxO3a signaling pathway.

Parkinson's disease；Rotenone；Apoptosis；Curcumin

1003-2754(2016)04-0299-04

2016-02-18；

2016-03-30

河南省基础与前沿技术研究计划项目(No.142300410461)

(郑州大学第二附属医院神经内科，河南 郑州 450014)

白宏英，E-mail：hybai@126.com

R742.5

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