miR-126在ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块中的表达

王　婷，潘旭东，马爱军，吴　梅，肖　星，孙清琳 ，王　兰



miR-126在ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块中的表达

王婷1，潘旭东1，马爱军1，吴梅2，肖星1，孙清琳3，王兰2

目的观察微小RNA(miR)-126及靶基因血管细胞粘附分子1(VCAM-1)在载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠颈动脉粥样硬化斑块中的表达，探讨miR-126与动脉粥样硬化斑块形成的关系。方法取8周龄ApoE-/-小鼠24只，随机分为对照组(假手术+普通饮食)、模型组(颈动脉套管术+高脂饮食)各12只。术后第8周末检测血浆中总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇的水平，HE染色观察颈总动脉斑块面积/血管面积，荧光定量PCR(RT-PCR)检测斑块内miR-126、VCAM-1 mRNA水平的表达，Western blot检测VCAM-1蛋白水平的表达。结果与对照组相比，模型组血脂水平明显升高(P<0.05)；模型组的颈动脉粥样硬化斑块面积/血管面积明显大于对照组(P<0.01)；miR-126表达水平在模型组明显低于对照组(P<0.01)；VCAM-1的mRNA及蛋白的表达在模型组明显高于对照组(P<0.01)。结论miR-126在颈动脉粥样硬化斑块中的表达下调可能在斑块形成过程中发挥重要作用。

动脉粥样硬化；ApoE-/-小鼠；miR-126；VCAM-1

miRNA是一类序列高度保守的非编码RNAs，可以通过与mRNA的3’-非翻译区(3’-untranslated region，3’-UTR)特异性结合，抑制蛋白质翻译或直接导致其降解，在转录后水平调控蛋白质的表达[1]。近年来研究表明miRNAs在胆固醇代谢[2]，平滑肌细胞表型转化、增殖、迁移[3～5]；血管新生[6]及内皮细胞衰老[7]；炎性反应[8]、泡沫细胞的形成[9]等多个过程中调控动脉粥样硬化的发生发展。miR-126是一种内皮细胞特异性表达的miRNA[10]，可促进内皮祖细胞的增殖和分化[11]，维持血管的完整性[12]，修复内皮细胞功能。已有研究显示miR-126可能通过调控其靶基因VCAM-1[13]、抑制内皮细胞炎性反应、延缓动脉粥样硬化的发展，但miRNA-126在颈动脉粥样硬化斑块中的变化尚不明确。颈动脉粥样硬化是脑血管病重要的危险因素，因此本研究旨在观察miR-126及VCAM-1在ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块中的表达变化，为进一步探讨miR-126在颈动脉粥样硬化中的作用机制提供新的线索。

1　材料与方法

1.1主要材料与试剂ApoE-/-小鼠，雄性，8周龄，SPF级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[scxk(京)2009-0015]。高脂饲料(0.25%胆固醇+15%脂肪)，购于北京华阜康生物科技股份有限公司。Trizol mRNA提取液、PCR上下游引物(生工生物工程股份有限公司，上海)。Prime ScriptTM miRNA qPCR Starter Kit Ver.2.0试剂盒(大连TaKaRa公司)。组织裂解液、0.45 μm PVDF膜(Solarbio公司，北京)。VCAM-1单抗(ab174279)(abcam公司，美国)。β-actin、ECL化学发光液(博士德公司，武汉)。

1.2研究方法

1.2.1动物模型与分组8周龄apoE-/-小鼠24只，饲养于青岛大学动物实验中心。随机分为两组：对照组、模型组。第1周所有小鼠均给予普通饮食。第2周模型组予以高脂饲料，对照组继续饲以普通饮食。第3周模型组行右颈总动脉套管术，对照组行右颈总动脉假手术[14]。所有小鼠于术后8 w处死取材。

1.2.2血脂水平测定股动脉穿刺取血，常规生化法测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。

1.2.3病理分析右颈总动脉远端、近端及套管处连续石蜡切片，片厚5 μm，随机选取10张做HE染色，使用IPP6.0测定小鼠颈总动脉粥样硬化斑块面积(即斑块处外弹力膜面积)和管腔面积，计算出斑块面积，斑块面积=血管面积-管腔面积，并计算出斑块面积与血管面积的比值(PA/LA)。

1.2.4实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测miR-126、VCAM-1的mRNA表达取小鼠右侧颈总动脉，加入TRzol mRNA提取液研磨，提取总RNA，总RNA以分光光度计测定RNA纯度和浓度,并反转录。引物序列如下：miR-126(71 bp)：5’CCGGCATTATTACTTTTGGTACG3’；VCAM-1(118 bp)：上游引物5’CCCAAACAGAGGCAGAGTGT3’，下游引物5’AGCAGGTCAGGTTCACAGGA3’；miR-126内参U6(TaKaLa试剂盒自带)；VCAM-1内参GAPDH：上游引物5’AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA3’，下游引物5’GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA3’。反应条件：miR-126：预变性(95 ℃ 30 s)，变性(95 ℃ 10 s)，退火延伸(60 ℃ 30 s)，共45个循环，相同的实验条件下重复3次；VCAM-1：预变性(95 ℃ 30 s)，变性(95 ℃ 10 s)，退火(55 ℃ 20 s)，延伸(72 ℃ 30 s)，共55个循环，相同的实验条件下重复3次。反应完成后计算机自动分析Ct值，采用2-△△Ct方法计算相对比值。

1.2.5Western blot检测VCAM-1的蛋白表达取小鼠右侧颈总动脉，加入组织裂解液和蛋白酶抑制剂研磨，提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。每组取20 μg样品，蛋白样品先80 V电泳30 min，进入分离胶，然后120 V电泳1 h至胶下端1 cm左右，将蛋白转移至PVDF膜上(15 V，45 min)，置于5%脱脂奶粉中室温封闭2.5 h，加一抗(VCAM-1，1∶2500；β-action，1∶200)室温下摇晃2 h，4 ℃冰箱过夜；用TBST液洗膜10 min×3次；加二抗(VCAM-1,1∶1500；β-action，1∶3500)室温下摇晃2 h；用TBST液洗膜10 min×3次；在膜上涂0.2 ml ECL发光液1 min，利用化学发光方法进行图像扫描，保存图像。使用Image J计算灰度值。

2　结　果

2.1动物体质量及血脂水平检测结果试验过程中两组小鼠体质量差异无统计学意义，对照组血脂水平明显低于模型组，差异有统计学意义(见表1)。

2.2颈总动脉内膜病理学改变两组颈总动脉内膜病理学改变，对照组无明显斑块，内膜光滑、完整，仅见极少量的泡沫细胞。模型组小鼠颈总动脉内有明显粥样斑块形成，管腔狭窄，内膜不规则增厚，完整性破坏，脂质浸润，大量泡沫细胞形成，平滑肌细胞增生并分泌大量细胞外基质，可见一些坏死物质及脂质沉积。模型组斑块面积/血管面积明显大于对照组(P<0.01)，说明模型制造成功，有明显的斑块形成。

2.3miRNA-126和VCAM-1 mRNA水平的表达与对照组相比，模型组miR-126表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，VCAM-1表达明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，提示动脉粥样硬化斑块中VCAM-1表达增多可能与miR-126低表达有关。

2.4VCAM-1蛋白水平的表达模型组VCAM-1表达明显高于对照组(P<0.01)，表明VCAM-1在动脉粥样硬化斑块中蛋白水平表达同样升高。

表1　各组小鼠体质量及血脂变化

与对照组比*P<0.05

3　讨　论

本实验选用颈总动脉套管及高脂饮食的ApoE/-小鼠，模型组血脂水平明显增高，小鼠颈总动脉套管处形成明显动脉粥样硬化斑块，该模型依赖低剪切力及高脂血症诱导颈动脉套管处近心端快速形成动脉粥样硬化斑块[15]，维持血管壁完整性，不造成中膜硬性损伤及血流中断，相对于血管拉伤或结扎后形成的动脉粥样硬化病变更接近人类病变的推进过程[16]，较广泛应用于研究颈动脉粥样硬化疾病。颈动脉粥样硬化是血管壁的一种慢性炎性疾病。内皮细胞活化后释放多种细胞因子并表达大量黏附分子，促使单核细胞黏附于内皮细胞并趋化迁移至内膜下，转变为巨噬细胞，吞噬低密度脂蛋白胆固醇形成泡沫细胞，参与动脉粥样硬化斑块的形成[17]。目前研究认为，黏附分子在动脉粥样硬化斑块形成过程中发挥了极其重要的作用，而VCAM-1是重要的黏附分子之一，其过表达是形成动脉粥样硬化斑块的关键启动步骤[18]。miR-126是一种内皮细胞特异性高表达的内源性小分子调节物质，近来，Zernecke等[19]研究发现，静脉注射miR-126，可以抑制小鼠主动脉粥样硬化病变，使主动脉粥状硬化斑块中巨噬细胞的面积减小，表明miR-126与动脉粥样硬化斑块的形成有密切关系。

本实验研究结果显示，颈动脉粥样硬化斑块中miR-126表达明显降低，VCAM-1 mRNA表达和蛋白表达均明显增高,表明动脉粥样硬化斑块的形成可能与miR-126低表达有关。已有研究显示[20]，在大动脉粥样硬化型脑梗死患者的血浆中miR-126的表达明显低于正常对照组。另外，Tian等研究发现[21],高脂肪喂养所致的动脉粥样硬化兔模型中，miR-126水平明显降低，而VCAM-1表达水平明显升高，这与我们的研究结果相符合。而且，Harris等[13]研究发现，miR-126表达水平降低时VCAM-1表达水平明显升高，相反，miR-126过表达时，VCAM-1表达水平明显降低，表明miR-126能够负反馈调节VCAM-1表达，控制血管内皮细胞的炎性反应。因此，我们认为在动脉粥样硬化疾病中，miR-126的低表达可能失去了对VCAM-1表达的抑制作用，从而不能抑制炎症细胞聚集，促进动脉粥样硬化斑块形成。

本研究通过观察miR-126及VCAM-1在ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块中的表达变化，表明miR- 126可能通过表达下调导致VCAM-1表达升高，促进了动脉粥样硬化发展，进一步证实了miR-126在动脉粥样硬化中的作用，为临床中动脉粥样硬化疾病的治疗提供了新的靶点。然而miR-126在动脉粥样硬化中的具体作用机制尚未十分明确，需要进一步基础和临床试验研究。

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The expression of miRNA-126 in carotid atherosclerotic plaques of ApoE-/-mice

WANGTing,PANXudong,MAAijun,etal.

(DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266100,China)

ObjectiveTo investigate the expression of microRNA-126 (miR-126) and the vascular cell-adhesion molecule-1 (VCAM-1) in carotid plaque,and the relationship between miR-126 and atherosclerotic lesion formations in apolipoprotein E-knockout (ApoE-/-) mice.MethodTwenty-four male ApoE-/-mice were randomized into two groups:control group (sham-operate+normal diet) and model group (perivascular collar placement+high-cholesterol diet).After eight weeks of operate,all mice were sacrificed.The serum levels of totals of total cholesterol (TC),triglyceride (TG),high-density lipoprotein-cholesterol (HDL-C) and low-density lipopoprotein (LDL-C) were measured by enzyme method.Pathological picture analysis was performed to calculate the ratio of area of carotid atherosclerotic plaque to area of vessel lumen.The expression of VCAM-1and miR-126 were measured by RT-PCR,and the expression of VCAM-1 also measured by Western blot.ResultAs compared with control group,the model group associated with a marked increase in TC,TG,LDL-C (P<0.05),and area of carotid atherosclerotic plaque (P<0.01),the expression of miR-126 was significantly decreased in mRNA levels (P<0.01),and the expression of VCAM-1 was significantly increased in mRNA and protein levels (P<0.01).ConclusionThe down-regulation of miR-126 in carotid atherosclerotic plaque may play an important role in the development of atherosclerosis.

Atherosclerosis;ApoE-/-mice;miR-126;VCAM-1

1003-2754(2016)04-0296-03

2016-02-19；

2016-03-30

国家自然科学基金(No.81571112)

(1.青岛大学附属医院神经内科，山东 青岛 266100；2.青岛大学基础医学实验中心人体显微结构学实验室，山东 青岛 266071；3.青岛大学医学院组织胚胎学教研室，山东 青岛 266071)

潘旭东，E-mail：drpan022@163.com

R743.1

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