蛛网膜下腔出血引起大鼠长期认知功能损害及其与海马小清蛋白阳性中间神经元细胞关系

毛仁玲，段　宇，高　幸，张　钰，张法永



蛛网膜下腔出血引起大鼠长期认知功能损害及其与海马小清蛋白阳性中间神经元细胞关系

毛仁玲1，段宇1，高幸1，张钰2，张法永3

目的探讨蛛网膜下腔出血(SAH)后大鼠认知功能损害及其海马区小清蛋白(PV)阳性中间神经元细胞数量变化。方法雄性成年SD大鼠随机分为对照组、假手术组和SAH组。在SAH术后20 w，采用8-臂迷宫实验测定动物的空间认知功能，应用免疫组织化学检测海马区PV阳性中间神经元数量。结果与对照组和假手术组大鼠相比，SAH组大鼠训练时间明显延长(P<0.05)；在记忆测试中，间隔1 h、12 h和24 h，3组准确率相似；而间隔2 h、3 h和6 h，SAH组大鼠的记忆正确率明显低于其它两组(P<0.05)，显示SAH引起长期记忆功能损害。免疫组化显示，SAH组CA1区和齿状回(DG)区PV阳性中间神经元细胞数明显低于其它两组(CA1，P<0.01；DG,P<0.05);CA2和CA3区3组之间未见明显差异。结论SAH可引起长期认知功能损害，这些损害可能与SAH引起海马CA1和DG区PV阳性中间神经元细胞数减少有关。

蛛网膜下腔出血；认知功能障碍；海马；小清蛋白阳性中间神经元细胞

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)引起脑血管痉挛和认知功能损害的治疗一直是临床难题，近年来对于SAH引起血管痉挛的预防和治疗取得显著进展，大大降低SAH引起血管痉挛的发生率和严重程度，但SAH引起的长期认知功能损害目前没有有效的治疗方法[1,2]。SAH引起海马损害是其引起认知功能损害的重要环节[3]，我们过去的研究显示SAH可引起海马区兴奋性氨基酸急性积聚，可能导致认知功能损害原因之一[4]。Han等[5]采用视交叉前池动脉血注射法能制造可靠的SAH痴呆模型， SAH后海马区神经元电生理反应发生改变，但未引起海马区细胞明显损害[5]。GABA能中间神经元细胞是海马区最主要的抑制中间神经元细胞，对海马区锥体细胞有重要调节作用，参与动物的认知功能，本研究选择有快速棘波特征的小清蛋白(Parvalbumin,PV)阳性GABA能中间神经元[6]，观察SAH后海马区该类型神经元细胞数目变化情况。

1　材料与方法

1.1试验材料Sprague-Dawley 大鼠(清洁级，上海斯莱克实验动物有限责任公司)，8-臂迷宫(Prof.William设计)， 小动物呼吸机100B(Anaheim,USA)，血液储存器、膜氧交换器(Cobe Micro,Cole-Parmer Instrument,USA)，1∶100兔抗大鼠抗CD11b和ED1(Sigma-Aldrich CO,USA)，生物素化羊抗兔IgG (Sigma-Aldrich CO,USA)。

1.2实验分组和处理健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重300～350 g，鼠龄10 w (上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，中国)。随机分为3组：对照组(Control)、假手术组(Sham)和蛛网膜下腔出血组(SAH)，每组10只。大鼠完成认知功能检查后做组织学检测。大鼠在SAH前后于实验室动物房内饲养，自由饮食，室温20 ℃～22 ℃，每日光照12 h，黑暗12 h。

1.3SAH模型手术方法参照Prunell等视交叉前池注射SAH模型[7]。大鼠在异氟醚吸入麻醉下，行气管插管和机械通气，通过调整呼吸参数，使大鼠动脉血CO2分压维持在38～42 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。手术过程行直肠温度监测，通过自动调节加热毯维持大鼠体温在(37.3±0.2)℃；作尾动脉穿刺监测动脉压；大鼠头立体定向仪固定后，正中切开头显示前囟，在其前7.5 mm旁开0.5 mm作颅骨钻孔，27号针头沿矢状前30度进针3 mm左右，到视交叉前池，SAH组注射0.25 ml动脉血，假手术组注射0.25 ml生理盐水，5 min后取出针头，骨蜡封骨孔。

1.4认知功能的检测和评价参照Williams的方法并改进[8～10]。SAH术后18 w，大鼠给予食物限量，每只大鼠饲料为10 g·d-1，连续2 w后，大鼠体重为限量进食前的85%左右并维持。术后20 w开始记忆功能训练。本研究采用8臂迷宫检测大鼠认知功能，8臂迷宫为木质灰色，中间直径为40 cm中央平台，与均匀放射排列的长60 cm、宽9 cm的8个臂相连，在臂的末端有直径为2 cm的食物凹槽。于训练第1、2天，将大鼠放在8臂迷宫内熟悉环境。第3天，在8臂迷宫中心和4个臂放置食物颗粒，用透明玻璃板关闭未置食物的其他4臂入口。将大鼠放在8臂迷宫中央，待大鼠吃完食物颗粒或在8臂迷宫内停留超过5 min，将大鼠放回饲养笼内；间隔5 min后，清除剩余食物。

在原来未放置食物的4个臂上放置食物颗粒，并开放8 臂入口，将大鼠再次放置在迷宫中心。待大鼠吃完食物或在迷宫内停留超过5 min，将大鼠放回饲养笼内，一次训练结束。大鼠身体通过入口为进入迷宫臂，大鼠进入迷宫臂并吃完臂里的食物为正确，其余均为错误。大鼠正确进入迷宫臂的次数除以大鼠进入迷宫臂总次数×100%作为大鼠觅食的正确率。

如果大鼠连续2 d吃完食物且正确率超过80%，进入第2阶段训练，将间隔时间由5 min延长到15 min，其余方法同第1阶段。如果连续2 d正确率超过80%，大鼠被认为已经学会寻食，可作记忆能力检查。将间隔时间延长到1 h、2 h、3 h、6 h、12 h和24 h，观察大鼠觅食的准确率。在检查结束后，间隔15 min对大鼠进行再次检查。如果准确率仍高于80%，认为大鼠仍处于学会状态。大鼠进入放置食物颗粒臂的正确率可反映大鼠的记忆能力，训练的天数用来评价学习能力。

1.5免疫组织化学检测标本获取：大鼠腹腔内注射10%水和氯醛麻醉后，经左心室灌注0.1 mol·L-1PBS(pH 7.4)，直至右心房流出无色液体后，改为灌注4%多聚甲醛固定。断头取出脑组织，作快速冰冻切片。分别行尼氏染色(4只/每组)和抗小清蛋白(6只/每组)免疫组化染色(试剂购自Sigma-Aldrich公司，美国)，观察海马区是否存在神经元细胞和PV阳性中间神经元细胞损害。

2　结　果

2.18-臂迷宫的训练时间在SAH术后20 w，采用8臂迷宫进行记忆功能训练，为达到连续2 d吃完食物且正确率超过80%，假手术组和对照组组间无差异，分别为13.8 d和12.9 d，SAH组大鼠所需训练时间较其他两组显著延长，需要17.6 d(P<0.05)(见表1)。

表1　8-臂迷宫的训练天数±s)

与对照组和假手术相比*P<0.05

2.2大鼠8臂迷宫内觅食的准确率经过第一、二阶段训练后，各组大鼠被认为已经学会觅食，即：间隔15 min 3组准确率超过80%，开始行记忆能力的检测(见表2)。随着间隔时间的延长，SAH组大鼠迷宫内觅食准确率较其它两组低，在间隔2 h、3 h和6 h具有显著性差异(P<0.05)。间隔12 h和24 h，3组无明显差异，提示间隔如此长时间可能使动物的整体记忆都明显下降。检查结束后，大鼠进行间隔15 min检查，3组动物准确率超过80%，大鼠在检查过程中一直处于“学会”状态。

2.3组织化学检测8-臂迷宫测试结束后，取各组大鼠脑组织行组织学检查。尼氏染色：结果显示海马区内神经元数目均无显著差异。抗小清蛋白(PV)细胞免疫组织化学染色：由于海马区不同部位的容易损伤程度和功能不同，参照Han等[11]将海马分为CA1、CA2、CA3和DG(齿状回)(见图1)。实验各组PV阳性中间神经元细胞计数(见表3)。对照组和假手术组在4个分区中PV阳性中间神经元细胞数量没明显差异；在 SAH组中，中间神经元细胞数在CA1区和DG较其他两组明显减少。

表2　8-臂迷宫记忆功能检测 ±s)

与对照组和假手术相比*P<0.05

表3　海马不同区PV阳性中间神经元细胞 ( ±s/mm2)

与对照组和假手术组相比*P<0.01；与对照组和假手术相比#P<0.05

图1抗PV免疫组化染色的海马(10×)(A为对照组；B为假手术组；C为蛛网膜下腔出血组；D为海马分区示意图)

3　讨　论

随着显微神经外科和血管内介入技术治疗动脉瘤技术不断发展，SAH患者预后较前有明显改善，其死亡率和严重致残率明显下降，但引起长期认知功能损害目前并无有效治疗方法，严重影响患者的社会回归和生活质量。本研究显示，SAH大鼠20 w后，其学习能力和空间记忆能力较对照组和假手术组明显下降，提示SAH大鼠存在长期认知功能损害。

海马在认知功能中起重要作用，各种因素导致海马损害是引起认知损害的中心环节[5，11]，在临床上可见一些患者SAH后海马体积变小，与认知功能下降正相关[12]。本研究中，通过尼氏染色，发现SAH大鼠海马区神经元细胞数量未见明显减少，结果与Han等[5]研究结果一致。通过免疫组织化学进一步研究发现，海马区GABA能中间神经元细胞主要亚型PV阳性神经元细胞在海马的部分区域明显减少，且以CA1区和DG下降明显。

海马CA1区与学习记忆等认知功能最为密切，CA1区神经元细胞对各种损害如缺氧、外伤和应激等最敏感，且最容易受到伤害，而海马的CA3区和DG区对各种损害的耐受性较高，因此CA1区神经损害可作为研究认知功能损害的组织学指标。Ouyavg等[13]认为CA1区神经最容易损害可能与该区星形胶质细胞受损害有关。海马其它部位在认知功能生理过程中也具有重要作用，DG对于多源性感觉输入、空间及相关联图形的分辨和颞叶长期记忆的整合等辅助编码具有关键作用，DG到CA3连接在海马的功能中起重要作用， DG病变可明显损害动物的近距离图像的分辨，因此在8-臂迷宫训练中需要更长的时间[14,15]。此外，和海马齿状回颗粒下区(subgranular zone,SGZ)存在有再生功能的神经干细胞,可分化成神经元细胞，整合到海马中，可能海马的CA3区和DG区对各种损害的耐受性较高的原因之一。

小清蛋白(PV)是一种钙结合蛋白，它只存在于灵长类和啮齿类动物特定的神经元细胞亚群。PV阳性中间神经元代表着高代谢和高电活动的GABA能神经元细胞亚群，是体现中枢神经抑制系统的主要标志，在控制该区神经元活动中起重要作用。该神经元细胞可以选择性与周围其他神经元细胞形成突触，通过抑制这些神经元细胞活动调节其兴奋性和活动性。海马区PV阳性中间神经元细胞对于各种损害因素如持续慢性应激反应、缺血缺氧等非常敏感，容易受到损害[16]。而该神经元细胞损害可导致动物的认知功能损害，最近Koh等[17]通过氯胺酮诱导小鼠PV阳性细胞损害后，动物的认知功能出现明显损害；也有研究表明，该类型细胞减少，导致的抑制降低同样会影响海马区锥体细胞的功能，损伤学习和记忆能力[18]。

DG对各种损害的耐受性高，可能SGZ存在可增生的神经干细胞有关，但本研究结果显示，SAH引起DG区域 PV阳性中间神经元细胞也明显减少，说明DG 中的PV阳性中间神经元细胞对有害反应抵抗能力较差。最近，Wei等[19]报道，癫痫可诱导 DG 中GABA能中间神经元细胞数量减少，并认为与神经元细胞的再生抑制有关，SAH引起PV阳性中间神经元细胞数量减少是否与抑制神经干细胞再生有关仍需进一步证实。

SAH引起中间神经元细胞损害的机制仍不清楚，SAH可引起氧化应激反应、炎症反应等，引起海马区细胞凋亡，或抑制神经元细胞再生等，导致该细胞数量明显减少。我们课题组曾报道[4]，SAH后早期海马区域局部兴奋性氨基酸大量释放和细胞Ca+超载等过度反应，可能是引起一系列神经损害如：自由基形成、细胞凋亡、炎性反应和各种损害基因表达等的启动位点，也可能是导致PV阳性细胞数量减少原因之一。

综上所述，本研究证实SAH可导致大鼠的长期认知功能损害，学习和记忆能力下降。SAH引起海马CA1和DG区PV阳性神经元细胞减少可能与大鼠的认知功能损害有关，而SAH选择性损害海马CA1和DG区PV阳性神经元细胞的机制还有待于进一步深入研究。

[1]Al-Khindi T,Macdonald RL,Schweizer TA.Cognitive and functional outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage[J].Stroke,2010,41:e519-e536.

[2]Tosun C,Kurland DB,Mehta R,et al.Inhibition of the Sur1-Trpm4 channel reduces neuroinflammation and cognitive impairment in subarachnoid hemorrhage[J].Stroke,2013,44:3522-3528.

[3]Sheldon S,Macdonald RL,Cusimano M,et al.Long-term consequences of subarachnoid hemorrhage:examining working memory[J].J Neurol Sc,2013,332:145-147.

[4]张法永,毛仁玲,陈衔城.蛛网膜下腔出血诱导小鼠长期认知功能损害[J].中国临床神经外科杂志,2010,7(4):183-186.

[5]Han SM,Wan H,Kudo G,et al.Molecular alterations in the hippocampus after experimental subarachnoid hemorrhage[J].J Cereb Blood Flow Metab,2014,34(1):108-117.

[6]Kaalund SS,Riise J,Broberg BV,et al.Differential expression of parvalbumin in neonatal phencyclidine-treated rats and socially isolated rats[J].J Neuroche,2013,124:548-587.

[7]Prunell GF,Mathiesen T,Svendgaard NA.A new experimental model in rats for study of the pathophysiology of subarachnoid hemorrhage[J].Neuroreport,2002,13:2553-2556.

[8]Williams CL,McGaugh JL.Enhancement of memory processing in an inhibitory avoidance and radial maze task by post-training infusion of bombesin into the nucleus tractus solitaries[J].Brain Res,1994,654:251-256.

[9]张法永,陈衔城,毛仁玲.低氧训练对短暂脑缺血引起认知功能损害的保护作用[J].中风与神经疾病杂志,2008,25(2):155-157.

[10]吴瀚峰,张钰,张法永.心肺体外循环后大鼠长期空间认知功能损害和海马区微胶质细胞激活[J].中国临床神经科学,2015，4:361-365.

[11]Han SR,Shin C,Park S,et al.expression of activating transcription factor-2 and c-Jun in the immature and adult rat hippocampus following lithium-pilocarpine induced status epilepticus[J].Yonsei Med J,2009,50(2):200-205.

[12]Bendel P,Koivisto T,Hanninen T,et al.Subarachnoid hemorrhage is followed by temporomesial volume loss:MRI volumetric study[J].Neurology,2006,67:575-582.

[13]Ouyang YB,Voloboueva LA,Xu LJ,et al.Selective dysfunction of hippocampal CA1astrocytes contributes to delayed neuronal damage after transient forebrain ischemia[J].J Neurosci,2007,27(16):4253-4260.

[14]Kesner RP.An analysis of the dentate gyrus function[J].Behav Brain Res,2013,254:1-7.

[15]Morris AM,ChurchwellJC,Kesner RP,et al.Selective lesions of the dentate gyrus produce disruptions in place learning for adjacent spatial locations[J].Neurobiol Learn Mem,2012,97:326-331.

[16]ZaletelI,Filipovi D,Puka N.Chronic stress,hippocampus and parvalbumin-positive interneurons:what do we know so far[J].Rev Neurosci,2016,ahead-of-print/revneuro-2015-0042.

[17]Koh MT,Shao Y,Sherwood A,et al.Impaired hippocampal-dependent memory and reduced parvalbumin-positive interneurons in a ketamine mouse model of schizophrenia[J].Schizophr Res,2016,S0920-9964(16):30023-30028.

[18]Yi F,Ball J,Stoll KE,et al.Direct excitation of parvalbumin-positive interneurons by M1 muscarinic acetylcholine receptors:roles in cellular excitability,inhibitory transmission and cognition[J].J Physiol,2014,592(16):3463-3494.

[19]Wei D,Yang F,Wang Y,et al.Degeneration and regeneration of GABAergic interneurons in the dentate gyrus of adult mice in experimental models of epilepsy[J].CNS Neurosci Ther,2015,21(1):52-60.

The study of long term dysfunction of cognition and its relationship with parvalbumin-postive interneurons at hippocampus in rats with subarachnoid hemorrhage

MAORenling,DUANYu,GAOXin,etal.

(DepartmentofNeurosurgery,HuadongHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China)

ObjectiveTo investigate the long-term cognitive impairment and the variation of parvalbumin-postive (PV) GABAergic interneurons following subarachnoid hemorrhage.MethodsThe Sprague-Dawley rats were randomly assigned to control,sham and SAH group.Twenty weeks later,the cognitive function was tested by 8-arm maze.Immunohistochemical study was used to detect PV-positive interneurons in hippocampus.ResultsCompared to the other two groups,SAH rats needed more days for training (P<0.05),that implied with the decreased ability in learning.In memorial test,all three groups had the same correct rate at the intervals of 1 h,12 h and 24 h,however,SAH rats showed a significant decrease at 2 h,3 h and 6 h (P<0.05).The number of PV-positive interneurons of SAH rats decreased significantly at CA1(P<0.01) and dentate gyrus (P<0.05).ConclusionSAH can cause long-term cognitive deficits in rats,which may cause by the decrease of PV-positive interneurons in CA1and DG.SAH leads to persist decrease some interneurons in hippocampus,which may be one of the key reasons for the long lasting cognitive impairment.

Subarachnoid hemorrhage;Cognitive impairment;Hippocampus;Parvalbumin-postive interneuron

1003-2754(2016)04-0292-04

2016-02-12；

2016-03-30

国家自然科学基金面上项目(No.81271296)

(1.复旦大学附属华东医院神经外科，上海 200040；2.加州大学圣地亚哥分校生物化学系细胞生物学专业，美国 加州 92093；3.复旦大学附属华山医院神经外科，上海 200040)

张法永，E-mail:zhangfayong66@sina.com

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