针刺对急性脑梗死大鼠海马区Cx43蛋白表达的影响

刘　坤，胡建功，张连城，肖震心，潘艳颖，杨宝旺，马　妍，郭富斌，王占奎

（1.天津中医药大学第二附属医院，天津300150；2.天津中医药大学，天津300193；3.长春中医药大学附属医院，长春130021）

针刺对急性脑梗死大鼠海马区Cx43蛋白表达的影响

刘坤1，胡建功1，张连城1，肖震心1，潘艳颖1，杨宝旺1，马妍2，郭富斌3，王占奎1

（1.天津中医药大学第二附属医院，天津300150；2.天津中医药大学，天津300193；3.长春中医药大学附属医院，长春130021）

目的观察针刺对缺血再灌注大鼠海马区缝隙连接蛋白Cx43蛋白表达的影响。方法将Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、非穴位针刺组及针刺组。采用改良的线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型，模型组、非穴位针刺组及针刺组内分设4个亚组，即缺血再灌注30 min组、缺血再灌注60 min组、缺血再灌注180 min组、缺血再灌注360 min组，每组10只。针刺组电针大鼠顶中线和顶旁线；非穴位针刺组取患侧肋下髂嵴上10 mm的固定点作为针刺点；模型组不予任何处理。采用免疫组化法测Cx43蛋白表达情况。结果针刺组不同时间脑缺血再灌注后行为障碍（Bederson’s）评分与非穴位针刺组和模型组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。模型组、针刺组和非穴位针刺组不同时间脑缺血再灌注后海马Cx43灰度值与正常组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。针刺组不同时间脑缺血再灌注后海马Cx43灰度值与模型组和非穴位针刺组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论针刺可以阻断Cx43的过度表达，干预大脑神经元缺血再灌注损伤，在缺血性脑损伤中发挥神经保护作用。

针刺疗法；脑梗死；缺血再灌注；Cx43；大鼠；电针

脑卒中是当今人类死亡率最高的三大疾病之一，是人类致残的主要原因。缺血性脑卒中源于脑血流减少和缺血性脑损伤，2006年Thompson RJ等［1］研究发现缺血缺氧条件能诱导神经细胞膜半通道的开放。脑缺血时连接蛋白43（Cx43）半通道的开放对神经元的影响已成为医学界关注的焦点。在特特条件下（缺血、缺氧、机械刺激等因素［2-3］），半通道可以被激活开放，导致各种物质通过该通道进出细胞，引起神经细胞的损伤。目前Cx43半通道已成为防治脑梗死时神经细胞死亡的一个重要的干预靶标，为脑梗死的诊治开辟了一个全新的研究方向。

本研究以Cx43为切入点，通过针刺干预大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，采用免疫组化检测Cx43在大鼠脑缺血再灌注实验模型中蛋白表达情况，探讨其在早期脑缺血时的分布规律以及针刺对大鼠缺血侧海马区Cx43蛋白表达的干预作用，为针刺早期治疗急性脑梗死提供一项重要指标及理论依据。

1　材料与方法

1.1动物模型制备及分组

健康清洁级雄性Wistar大鼠，体重250～300 g。按Longa改良的线栓法［4］制备动物脑缺血再灌注模型，缺血1 h后拔出线栓实现再灌注。采用Zausinger6分法［5］对其神经功能进行评分，判断模型成功与否。根据SPSS13.0生成的随机表，随机分为正常组、模型组、非穴位针刺组及针刺组。模型组及针刺组再分设4个亚组，即再灌注30 min组（I/R-30 min）、再灌注60 min组（I/R-60 min）、再灌注180 min组（I/R-180 min）和再灌注360 min组（I/R-360 min）。每组10只。

各组于相应操作后1 h观察动物行为障碍的程度，参考Bederson JB等［6］评分标准记分。①动物有不停地向一侧转圈者，记1分。②提鼠尾离开地面30 cm，观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，记为0分；如手术对侧前肢出现腕屈曲、肘屈曲、肩内旋或既有腕、肘的屈曲又有肩内旋者，分别记为1、2、3、4分。③将大鼠两前肢置一金属网上，观察大鼠两前肢的肌张力，双侧肌力对等且有力者记为0分，同样根据手术对侧前肢肌张力下降程度不同记为1、2、3分。④将大鼠放于平地上，分别推其双肩向对侧移动，检查阻力，如双侧对等且有力，记为0分；当向手术对侧推动时阻力下降者，可根据下降程度不同分为轻、中、重3度，分别记为1、2、3分。

1.2实验主要仪器和试剂

SFC-12体视显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；FluoView™FV1000型共聚焦激光扫描显微镜（日本奥林巴斯公司）；HPIAS-1000彩色图像分析系统（同济医科大学千屏影像工程公司）；红四氮唑（TTC，Sigma公司产）；APES粘片剂、高效切片石蜡、苏木素、伊红（天津瑞科生物技术有限公司）。

1.3实验方法

1.3.1治疗方法

针刺组取顶中线（MS5，百会向至前顶）、顶旁线（相当于国标顶旁2线MS9，承灵与正营连线）作为针刺穴位［7］。造模成功后，将大鼠固定于实验台上，用长25 mm的毫针沿皮刺入大鼠顶中线和顶旁线，然后接电针仪（KWD-8081，长城牌），用疏密波，频率为2/15 Hz，电流强度为1 mA，强度以肢体轻微抖动为宜，留针10 min。非穴位针刺组选取患侧肋下髂嵴上10 mm的固定点作为针刺点。正常组和模型组同样抓取，不作其他处理。

1.3.2切片制备

(2)察汗乌苏河地区1∶25 000地球化学测量圈定综合异常60个，显示异常元素种类多，元素组合明显，异常强度高，浓集中心明显，为后期找矿工作提供了较为详实的地球化学资料。

大鼠于规定时间点断头取脑。去掉小脑和低位脑干，将待检测缺血侧脑组织在前联合水平沿冠状切面切下厚约2 mm的脑片，置于4%多聚甲醛中固定。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。用切片机行连续冠状切片，厚5 μm，行HE和免疫组化染色。分别在低倍和高倍显微镜下观察脑组织缺血区（海马）病理变化，每张切片在缺血侧半影区随机选取5个视野，用HPIAS-100多媒体彩色病理图文分析系统进行图像分析，光镜下观察组织形态学变化。

1.3.3HE染色步骤

将石蜡切片放于60℃恒温培养箱烘烤2 h，取出后至室温；二甲苯透明脱蜡各10 min；梯度乙醇脱水各1 min；苏木素染色5 min，清水冲洗1 min；乙醇分色1 min，清水冲洗1 min；伊红染料复染20 s至1 min；梯度乙醇脱水各1 min；二甲苯透明，中性树胶封片；光镜下观察脑组织染色情况。

1.3.4免疫组化具体步骤

将石蜡包块切成厚度为5 μm连续组织切片，贴于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，60℃烘烤1 h。将切片先后用二甲苯脱蜡、乙醇常规至水化。切片放入盛有柠檬酸盐的缓冲液中，再放入微波炉内用中高档进行抗原修复8 min，自然冷却至室温。1%甲醇双氧水，室温10 min，消除内源性过氧化酶活性，PBS洗3次，每次5 min。滴加10%山羊血清封闭液，室温20 min，勿洗。滴加一抗，4℃过夜，PBS洗3次，每次5 min。滴加生物素化二抗（IgG），37℃孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20 min，PBS洗3次，每次5 min。DAB显色使用DAB显色试剂盒，1 mL蒸馏水加显色剂A、B、C各1滴，混匀，滴加至切片上，光学显微镜下观察，以棕黄色为阳性表达，显色约10 min，自来水冲洗终止显色。苏木素复染1 min，自来水返蓝。经梯度乙醇脱水、二甲苯透明及中性树脂封片，再通过显微镜观察，进行显微照相（×400）。

1.3.5图像分析

每个组别选取3张切片，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），经过微机程序处理进行测定，测量值为每个视野下阳性反应的平均光密度。背景值为同一张切片上胼胝体的平均光密度值，用前者减去后者可以得到矫正的平均光密度值。

1.4统计学方法

2　结果

2.1各组大鼠症状体征及神经功能评价

实验过程中共有7只动物在术中或术后死亡，死亡率为5.8%。死亡后大鼠断头取脑发现4只为脑出血，另3只行TTC染色发现手术同侧大面积脑梗死，甚至对侧也出现梗死，并有严重脑水肿，部分已经液化。上述动物未列入行为障碍评分分析。另取7只大鼠造模后，补充入相应组内。正常组无大鼠死亡。

大鼠苏醒后，除正常组动物外，各组动物多有不同程度的神经症状体征表现，主要为一般精神状态较差，精神萎靡，反应迟钝。鼠毛蓬乱竖起，动作缓慢或活动减少，行动不协调，屈曲姿势，表现为不同程度的手术对侧前肢内收、屈曲，力弱，爬行时向一侧转圈，严重者不能前行、原地转圈或偏瘫（不能站立和行走）。针刺组不同时间脑缺血再灌注后行为障碍（Bederson’s）评分与非穴位针刺组和模型组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

2.2各组HE染色脑组织病理变化情况

正常组各时间点显微镜下可见各区域脑组织结构致密，层次清晰，细胞轮廓正常，核居中，细胞排列规则，核仁清楚，神经细胞及毛细血管周围间隙正常，毛细血管内可见红细胞，神经细胞无肿胀、核深染。模型组I/R-30 min亚组可见梗死区脑组织水肿，局灶性细胞核固缩，小部分神经细胞肿胀，细胞轮廓模糊，神经细胞和胶质细胞明显减少；模型组I/R-60 min亚组可见神经细胞变性、凋亡、坏死，排列无规则，神经元脱失严重，神经细胞肿胀，部分细胞核固缩深染；模型组I/R-180 min亚组缺血中心区神经元、胶质细胞和血管大量坏死显著，神经细胞排列紊乱，极向不清，有空泡变，核结构不清，细胞骨架消失或严重破坏；模型组I/R-360 min亚组上述现象进一步加重，周围可见较多凋亡细胞，病灶中心可见大量固缩核和核碎片，表现为神经元坏死、变性、胞核浓缩、浓染、胞浆肿胀。针刺组各亚组神经元、胶质细胞、毛细血管结构恢复程度等方面与同时间点模型组亚组比较，改善明显。非穴位针刺组各亚组对以上结构损伤没有改善作用。

2.3各组Cx43阳性细胞变化情况

正常组可见棕黄色着色颗粒，均有Cx43阳性表达，分布于星形胶质细胞膜及周围突起；模型组各亚组海马区均有Cx43阳性表达，较正常组着色颗粒明显减少，分布于星形胶质细胞膜及周围突起，随缺氧、缺血后时间的推移，Cx43阳性表达有逐渐增加的趋势；针刺组各亚组着色颗粒随时间的延长而逐渐增加，与模型组比较，Cx43阳性表达呈逐渐降低的趋势；非穴位针刺组各亚组对Cx43阳性表达无明显改善。详见图1。

表1　各组大鼠行为障碍（Bederson’s）评分比较（x±s，分）

图1　各组大鼠脑缺血再灌注后海马Cx43阳性细胞变化

表2　各组大鼠脑缺血再灌注后海马Cx43阳性细胞平均灰度值比较（x±s，个/半侧切面）

模型组、针刺组和非穴位针刺组不同时间脑缺血再灌注后海马Cx43灰度值与正常组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。针刺组不同时间脑缺血再灌注后海马Cx43灰度值与模型组和非穴位针刺组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

3　讨论

间隙连接是一个低电阻的细胞间通道，参与信号的传递和保持代谢的连续性。间隙连接的基本结构是连接蛋白，大脑中星形胶质细胞间具有广泛的间隙连接，主要由Cx43构成。Cx43形成的通道主要有半通道和间隙连接通道［8］。在正常生理情况下，间隙连接通道处于开放状态，允许细胞间通讯，而半通道则处于关闭状态［9］。半通道是目前认为相邻细胞间唯一能直接进行能量、物质和信息交换的一种特特通道，广泛存在于神经系统中，在神经细胞的分化、发育和生理功能的调节中起重要的作用［10］。在缺血缺氧等因素下，半通道可被激活开放，导致各种物质通过该通道进出细胞，导致神经细胞的损伤。半通道的基本结构单位为连接蛋白，Cx43是神经系统内的主要连接蛋白，在哺乳动物脑组织中表达最强，且在神经系统信号传递及各种反应中发挥重要作用。大脑缺血再灌注损伤常对病灶周围的神经元造成不可逆的损伤，危害极大。Cx43参与大脑的缺血再灌注损伤，在脑缺血再灌注损伤的不同阶段都发挥重要作用。在脑缺血再灌注过程中半通道的开放是一个随着时间而递增的过程。有研究［11］表明，缺血初期半通道仅有少量开放，之后开放量有显著增加，尤其是再灌注初期，刺激诱导更大量的半通道开放。随着Cx43的表达增强，间隙连接产生跨细胞膜信号，加剧神经细胞损伤。其机制可能为缺血缺氧后，早期产生的一系列代谢应激信号如钙流、氧自由基、兴奋性氨基酸等毒性物质通过增强的Cx43半通道迅速跨膜传导进入周边细胞，使病变范围扩大，加重半暗区的凋亡，加重脑损伤［12］。因此，阻断Cx43半通道表达可减少神经元的独立生存能力，而合理调控Cx43的表达可预防大脑神经元缺血再灌注损伤。

针刺作为一种天然的“阻滞剂”在干预Cx43在大脑缺血再灌注损伤的过程中起着重要作用。本实验结果显示，模型组各时间点海马星形胶质细胞的Cx43表达均较正常组明显增强，脑损伤后30 min Cx43表达已开始增加，随着时间变化逐渐增强至360 min最为明显，这种变化规律与脑组织病理改变严重程度、神经细胞凋亡的时间框架是相吻合的，并且Cx43发生变化开始时间早于细胞凋亡出现的时间，说明星形胶质细胞Cx43表达的增强参与了大鼠急性脑损伤的病理形成过程。而针刺能明显改善急性脑梗死大鼠形态学的变化，如减轻神经细胞水肿状态、减小梗死区域、抑制炎性细胞的浸润等。这与针刺可以阻断Cx43的过度表达，干预大脑神经元缺血再灌注损伤有关。

［1］Thompson RJ，Zhou N，Macvicar BA.Ischemia opens neuronal gap junction hemichannels［J］.Science，2006，312（5775）:924-927.

［2］刘泰槰，Ross G Johnson，Judson D Sheridan.机械刺激在间隙连接半通道活动中的作用［J］.生物物理学报，2000，16（3）:468-474.

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Effect of Acupuncture on Cx43 Protein Expression in the Hippocampal Region in Rats with Acute Cerebral Infarction

LIU Kun1，HU Jian-gong1，ZHANG Lian-cheng1，XIAO Zhen-xin1，PAN Yan-ying1，YANG Bao-wang1，MA Yan2，GUO Fu-bin3，WANG Zhan-kui1.1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital，Tianjin 300150，China；2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Changchun University of Traditional Chinese Medicine Hospital，Changchun 130021，China

ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture on gap junction protein Cx43 expression in the hippocampal region in ischemia/reperfusion rats.MethodsWistar rats were randomized into normal，model，non-point acupuncture and acupuncture groups.A rat model of focal cerebral ischemia/reperfusion was made by modified middle cerebral artery thread occlusion.The model，non-point acupuncture and acupuncture groups were separately divide into four subgroups:30，60，180 and 360 min ischemia/reperfusion，10 rats each.The middle and lateral lines of vertex were given electroacupuncture in the acupuncture group of rats.A subcostal fixed point 10 mm above the iliac crest on the affect side was selected as an acupuncture point in thenon-pointacupuncturegroup.Themodelgroupwasnottreated.Cx43proteinexpressionwasdeterminedby an immunohistochemical method.ResultsThere was a statistically significant difference in the behavior disorder（Bederson’s）score between the acupuncture group and the non-point acupuncture or model group after different times of cerebral ischemia/ reperfusion（P＜0.05）.There was a statistically significant difference in hippocampal Cx43 content between model，acupuncture or non-point acupuncture group and the normal group and between the acupuncture group and the model or non-point acupuncture group after different times of cerebral ischemia/reperfusion（P＜0.05）.ConclusionsAcupuncture can inhibit the overexpression of Cx43，intervene in cerebral ischemia-reperfusion injury and produce a neuroprotective effect in ischemic brain injury.

Acupuncture therapy；Cerebral infarction；Ischemia/reperfusion；Cx43；Rats；Electroacupuncture

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.01.0090

1005-0957（2016）01-0090-04

国家自然科学基金项目（81102640）；天津市应用基础与前沿技术研究计划（14JCZDJC36800）

刘坤（1978-），女，检验医师

王占奎（1977-），男，主治医师，Email:wzk21cn@163.com

2015-09-03