通督调神针灸预处理对脑缺血再灌注大鼠miRNA664及MMP9调控机制的研究

郑仕平，韩　为，储浩然，王　颖，张　玲，张国庆，朱玲玲

（安徽中医药大学第二附属医院，合肥230061）

通督调神针灸预处理对脑缺血再灌注大鼠miRNA664及MMP9调控机制的研究

郑仕平，韩为，储浩然，王颖，张玲，张国庆，朱玲玲

（安徽中医药大学第二附属医院，合肥230061）

目的探讨通督调神针灸预处理对脑缺血再灌注大鼠神经行为功能和脑水含量的影响及miRNA664、MMP9表达的调控作用机制。方法将130只Wistar大鼠随机分为A组（电针预处理组）30只、B组（艾灸预处理组）30只、C组（阿司匹林预处理组）30只、D组（模型组）30只和E组（空白对照组）10只。A组进行电针治疗；B组用清艾条悬灸；C组用阿司匹林10 mg/kg灌胃。治疗7 d后各组进行脑缺血再灌注模型制作，于再灌注后24 h，观察大鼠神经行为功能和脑水含量以及皮质区相关miRNA、MMP9的表达。结果A组、B组、C组和D组神经行为学评分与E组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。A组、B组神经行为学评分与C组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。A组神经行为学评分与B组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。A组、B组、C组和D组脑水含量、miRNA664相对表达量及MMP9相对表达量与E组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。A组、B组和C组脑水含量、miRNA664相对表达量及MMP9相对表达量与D组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。A组和B组脑水含量、miRNA664相对表达量及MMP9相对表达量与C组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。A组脑水含量、miRNA664相对表达量及MMP9相对表达量与B组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。结论通督调神针灸预处理可有效降低脑缺血再灌注大鼠的神经行为学评分和脑水含量，并通过调控miRNA664的表达降低MMP9相对表达量。通督调神针灸预处理脑保护机制之一可能通过调控miRNA664的表达降低MMP9相对表达量，诱导脑缺血耐受，减轻脑水肿。

针灸疗法；通督调神；miRNAs；MMP9；大鼠；电针Reperfusion Injury再灌注损伤（再查一下）

随着缺血性脑血管病发病率的上升和致死致残率的增加，其发病前期的预防性治疗更加有其必要性和重要性。而针灸预处理治疗以其操作方便，对机体副反应小而更有应用推广价值。

本研究通过观察通督调神针灸预处理对脑缺血再灌注大鼠相关miRNAs的调控，评价通督调神针灸预处理对脑卒中预防的效果，探讨通督调神针灸预处理对脑缺血再灌注大鼠相关miRNAs的调控机制，现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物及分组

选择130只清洁级健康雄性Wistar大鼠，月龄3～4个月，体重250～300 g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供。经1星期适应性饲养后开始实验。采用随机数字法分为A组（电针预处理组）30只、B组（艾灸预处理组）30只、C组（阿司匹林预处理组）30只、D组（模型组）30只和E组（空白对照组）10只。

1.2药品及试剂

阿司匹林肠溶片（南京白敬宇制药有限责任公司）；清艾条（南洋艾灸厂订做）；ECL超敏发光试剂盒（Thermo公司）；AQP4（Bioworld公司）；MMP-9（Boster公司）；one-step qPCR Kit、rno-miRNA-494-3p、rno-miRNA-290、rno-miRNA-664-3p（Biomics公司）；核酸染料（赛百盛GoldView公司）。

1.3主要实验仪器

SDZ-Ⅱ型电针治疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）；QUICK型电凝针（常州速骏电子有限公司）；DHG-9140型干燥箱（上海精宏实验设备有限责任公司）；EPS 300型电泳仪、VE-180型电泳槽、VE-186型转膜仪、垂直板电泳槽（Tanon公司）；普通PCR仪（杭州晶格科学仪器有限公司）；荧光定量PCR仪（Thermo PIKOREAL 96）；PIKO Plate Illuminator（Thermo公司）；针灸针（0.25 mm×13 mm）。

1.4动物模型制备及治疗

1.4.1动物模型制备

模型制备大鼠大脑中动脉梗死（MCAO）模型制备参照Zea Longa方法进行，并加以改进。除E组外，其余各组大鼠以3%水合氯醛（1 mL/100 g体重）腹腔注射麻醉，颈前皮肤正中切口，暴露左侧颈三角，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），结扎、切断、游离ECA主干，在其根部用l号线打1个松结，用缝合线暂时阻断CCA和ICA血流，在ECA残端剪1个约相当于ECA直径2/3大小的切口，将制备好的栓线插入ICA，至阻断ICA血流处，不完全结扎ECA根部丝线，去除暂时阻断ICA血流的缝合线，线栓从颈外动脉插入，进入颈内动脉颅内段，当遇有轻微阻力时停止，结扎ECA根部丝线，去除暂时阻断CCA血流的缝合线。栓线插入深度为19～22 mm，经ICA分叉轻插入颅内至大脑前动脉（ACA），消毒、缝合皮肤。2 h后再次麻醉大鼠，剪开切口缝合线，拔出栓线，使其头端置于ECA残端，使CCA、ICA血流再通。以再灌后不能完全伸展对侧前爪，或行走时向对侧转圈，或站立不稳，向对侧倾倒并存活至规定时间点为模型成功的标准。

1.4.2治疗方法

A组取天门、百会、大椎。天门穴、百会穴平刺进针3 mm，大椎穴斜刺3 mm，针刺后百会和大椎穴接电针治疗仪，选用频率为2/5 Hz的疏密波，电流强度为1～2 mA。每日1次，每次持续20 min，共治疗7 d。

正说着，嘚嘚嘚的高跟鞋声由远而近，鲁冰莹又走了进来，她心有不甘地对护士们说：“告诉大家个秘密，颜副院长才是名副其实的‘工业酒精’，他几年前把一个女学生搞大了肚子，那女学生的姐夫是个局长，准备告他，《起诉书》都写好了。后来，女学生的姐姐怕坏了她妹妹的名声和前程，才让颜副院长赔一笔‘青春损失费’了事。”

B组将大鼠头部固定，保持其清醒状态下，选取百会、天门、大椎穴剃毛点记，用清艾条悬灸20 min。每日1次，治疗7 d。

C组根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”确定大鼠的灌胃药量，大鼠每千克体重需要阿司匹林0.01 g。将阿司匹林片研磨成粉末，与蒸馏水混合成0.01 g/mL浓度的溶液，按大鼠所需要的药物量进行给药。每日1次，治疗7 d。

D组与E组同各组平行饲养，不做任何处理。

1.5检测指标与方法

1.5.1神经行为功能测定

动物于手术结束后放回笼中进行观察，自由饮食。于再灌注后24 h，由不了解分组情况的观察者进行神经功能评分，评分方法分为有自发探究记0分，刺激时能走动记1分；正常步态记0分，共济失调记1分；爬行记2分，无步态记3分；能进食记0分，不能进食记1分；能饮水记0分，不能饮水记1分；疼痛刺激可移动记0分，仅头或躯干运动记1分，肢体回缩或无反应记2分。

1.5.2脑水含量测定

1.5.3miR664表达测定

1.5.3.1RNA的提取

将50 mg组织或细胞标本中加入1 mL Trizol（Invitrogen公司）匀浆，静置5 min，加氯仿0.2 mL，混匀后静置5 min，4℃12000×g离心15 min，吸取上层无色液相，加入0.5 mL异丙醇，静置15 min，4℃12000×g离心15 min，可见RNA沉淀，弃上清，加75%乙醇1 mL混匀，4℃7500×g离心5 min，弃上清，无RNA酶水溶解。采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，分光光度计检测RNA浓度及纯度。

1.5.3.2逆转录实时定量PCR检测miR664的表达

①一步法miRNA定量体系的建立。取总RNA0.1～100 ng进行逆转录反应，反应体系为总RNA 0.1～100 ng、2×Master mix 12.5 μL、50×SYBR GreenⅠ0.5 μL、RT Primer（10 μM）0.5 μL、Forward Primer（10 μM）0.5 μL、Reverse Primer（10 μM）0.5 μL、DEPC-H2O补至25 μL。②实时定量PCR反应程序。反转录，37℃～42℃60 min；热失活变性，95℃10 min；扩增，95℃20 s，62℃30 s，72℃30 s，进行45个循环。以上各步骤中，反应体系以及试剂用量均严格按照EzOmicsTMmiRNA qPCR Detection Kit（Biomics公司）说明书进行操作。miR664相对表达量分析方法为relative quantification study，分析所采用的指标为2-△△Ct。

1.5.4基质金属蛋白9表达测定

应用免疫组织化学技术（Western Blot法）检测脑组织基质金属蛋白9（MMP9）的表达。剪取组织约100 mg，加入RIPA细胞裂解液1 mL（内含1 mM PMSF）后提取总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳，电转膜后将蛋白转印至硝酸纤维素膜，采用5%脱脂牛奶封闭2 h后，使用TBS洗膜，再加一抗MMP9（92kDa）和内参beta-actin抗体，4℃过夜。加入洗涤液（TBST），每次洗涤10 min，共洗涤3次。最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗作用2 h，洗膜后加入ECL化学发光试剂显影。

1.6统计学方法

实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS17.0进行数据处理，采用单因素方差分析比较均数间的差异。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1各组神经行为学评分比较

由表1可见，A组、B组、C组和D组神经行为学评分与E组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。A组、B组神经行为学评分与C组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。A组神经行为学评分与B组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

表1　各组神经行为学评分比较（x±s，分）

2.2各组脑水含量比较

由表2可见，A组、B组、C组和D组脑水含量均明显提高，与E组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。A组、B组和C组脑水含量与D组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。A组和B组脑水含量与C组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。A组脑水含量与B组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2　各组脑水含量比较（x±s，%）

2.3各组miRNA664相对表达量比较

由表3、图1及图2可见，A组、B组、C组和D组miRNA664相对表达量与E组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。A组、B组和C组miRNA664相对表达量与D组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。A组和B组miRNA664相对表达量与C组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。A组miRNA664相对表达量与B组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3　各组miRNA664相对表达量比较（x±s，2-△△Ct）

2.4各组MMP9相对表达量比较

由表5、图3可见，A组、B组、C组和D组MMP9相对表达量与E组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。A组、B组和C组MMP9相对表达量与D组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。A组和B组MMP9相对表达量与C组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。A组MMP9相对表达量与B组比较，差具有统计学意义（P＜0.05）。

表3　各组miRNA664相对表达量比较（x±s，MMP9/β-actin）

图1　miRNA664扩增曲线图

图2　miRNA664溶解曲线图

图3　Western印迹检测MMP9蛋白的表达

3　讨论

miRNA是一类新发现高度保守的内源性非编码RNA，大小长约19～23个核苷酸，大部分是由内含子部位产生，成熟miRNA碱基互补配对的方式识别靶mRNA分子并诱导靶降解或/和翻译抑制，调控基因表达。miRNA在中枢神经系统含量丰富，参与调节神经系统的生长发育，而同时也参与神经系统重大疾病的发生发展相关，如缺血性脑血管病、神经退行性疾病、神经系统肿瘤等［1］。多项研究［2-5］表明，大鼠大脑中动脉闭塞造成的局灶性脑缺血能够明显改变多种miRNA的表达，它们调节一些介导神经元保护、受体功能以及炎症基因表达，从而调控卒中的病理生理学过程。

急性局灶性脑缺血导致神经细胞内能量耗竭，造成跨膜电位消失、Ca2+内流和谷氨酸释放，最终导致细胞死亡。促进缺血预适应（ischemic precondition，IPC）是指组织在经历多次短暂缺血后产生一定的“自我”保护作用，使其对随后较长时间的缺血耐受性明显增强的现象［6］。已知预处理诱导脑缺血耐受需要合成新蛋白，并短暂性地抑制基因表达。有研究［7］通过检测miRNA在新蛋白合成中的调节作用，揭示了预处理可通过调控miRNA在小鼠脑皮质中的表达，下调miRNA的一个显著的预测靶基因是甲基-CpG结合蛋白2（methy1-CpG binding protein2，MeCP2）。MeCP2在耐受中的作用可能抑制非必要基因同时，激活细胞存活所需要的必要基因。研究发现，包括miR-132在内的许多miRNA可与MeCP2的3’-UTR结合，小鼠皮质IPC能诱导miR-132显著下调，MeCP2蛋白快速增加。由于具有甲基-DNA结合剂转录抑制域，MeCP2被认为是一种广谱性转录抑制剂。该研究表明，MeCP2应为诱导IPC所必需，而某些miRNA的下调可上调MeCP2表达，从而促进IPC。

miRNA-497作用于bcl-2，它在小鼠短暂性MCAO时可被诱导表达。研究证明，mir-497能抑制bcl-2/-w的翻译。在体内应用antagomir-497能有效降低miR-497水平，相应地提高bcl-2/-w蛋白水平，从而减轻MCAO导致的梗死和神经元损伤［8］。在脑缺血模型中，miR-21是一种很强的抗凋亡因子。在大鼠脑缺血模型中，缺血边缘区神经元内miR-21水平较对侧半球显著增高。在培养的皮质神经元中，miR-21过度表达可显著地抑制OGD诱导的细胞凋亡，表明miR-21过度表达可保护缺血神经细胞。另外，神经元过度表达miR-21还能显著降低Fas配体水平，而后者是一种重要的细胞死亡诱导配体，这很可能是miR-21神经保护作用的机制之一［9］。另一项研究发现，miR-21耗竭会减少细胞增殖并增加细胞凋亡，其靶基因包括PTEN和bcl-2［10］。

MMP9属于Ⅳ型胶原酶，也称明胶酶，它能有效分解基底膜及细胞外基质的主要成分［11］。MMP9合成后以酶原形式存在，被特特的蛋白酶切割后产生活性，导致白细胞浸润［12］。体内许多炎性细胞因子［如IL-6、IL-18肿瘤坏死因子-α（TNF-α）］，生长因子及其他MMP的激活均能诱导或刺激MMP9在转录水平的表达。现已证实MMP9的水平与不稳定斑块呈正相关［13］。国内外的研究都已显示，MMP9在脑梗死的发生与发展中起重要作用［14-15］。在永久性脑缺血大鼠模型中，脑缺血24 h血浆与脑组织MMP9活性皆显著升高［16］，MMP9活性被抑制与神经元损伤减少呈正相关［17］。研究发现MMP9能降解ECM，在血脑屏障的破坏、脑水肿的形成过程中发挥着重要作用［18-19］，并能将细胞与基质间相互作用的微环境破坏，诱导神经细胞的死亡，导致神经功能障碍［20］。

Jeyaseelan K等［4］结合DNA芯片分析发现miR -125a、miR 290、miR-664调节MMP9基因的表达。同时也发现，miR-664与MMP9表达变化一致，这说明两者之间可能存在调控与被调控关系。MMP9与血脑屏障的破坏和血管源性脑水肿密切相关。据此推测miRNA可能通过调控其靶基因表达而参与脑梗死后脑水肿形成。

本实验研究发现通督调神针灸预处理可有效降低脑缺血再灌注大鼠的神经行为学评分和脑水含量，并通过调控miRNA664的表达降低MMP9相对表达量，诱导脑缺血耐受，减轻脑水肿，这可能是通督调神针灸预处理脑保护机制之一。

［1］Li JS，Yao ZX.MicroRNAs:novel regulators of oligodendrocyte differentiation and potential therapeutic targets in demyelinationrelated diseases［J］.Mol Neurobiol，2012，45（1）:200-212.

［2］Liu DZ，Tian Y，Ander BP，et al.Brain and blood microRNA expression profiling of ischemic stroke，intracerebral hemorrhage，and kainate seizures［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2010，30（1）:92 -101.

［3］Dharap A，Bowen K，Place R，et al.Transient focal ischemia induces extensive temporal changes in rat cerebral microRNAome［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2009，29（4）:675-687.

［4］Jeyaseelan K，Lim KY，Armugam A.MicroRNA expression in the blood and brain of rats subjected to transient focal ischemia by middle cerebral artery occlusion［J］.Stroke，2008，39（3）:959-966.

［5］Tan KS，Armugam A，Sepramaniam S，et al.Expression profile of MicroRNAs in young stroke patients［J］.PLoS one，2009，4（11）: e7689.

［6］Dirnagl U，Becker K，Meisel A.Preconditioning and tolerance against cerebral ischaemia:from experimental strategies to clinical use［J］. Lancet Neurol，2009，8（4）:398-412.

［7］Lusardi TA，Farr CD，Faulkner CL，et al.Ischemic preconditioning regulates expression of microRNAs and a predicted target，MeCP2，in mouse cortex［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2010，30（4）:744-756.

［8］Yin KJ，Deng Z，Hamblin M，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor delta regulation of miR-15a in ischemia-induced cerebral vascular endothelial injury［J］.J Neurosci，2010，30（18）:6398-6408.

［9］Yin KJ，Deng Z，Huang H，et al.miR-497 regulates neuronal death in mouse brain after transient focal cerebral ischemia［J］.Neurobiol Dis，2010，38（1）:17-26.

［10］Buller B，Liu X，Wang X，et al.MicroRNA-21 protects neurons from ischemic death［J］.FEBS J，2010，277（20）:4299-4307.

［11］刘爱东，庞久玲，刘士生.胃癌中基质金属蛋白酶-9和CD105表达关系的研究［J］.中国老年学杂志，2009，29（7）:886-887.

［12］del Zoppo GJ，Milner R，Mabuchi T，et al.Microglial activation and matrix protease generation during focal cerebral ischemia［J］. Stroke，2007，38（2 Suppl）:646-651.

［13］Zhang X，Chirstenson LK，Nothnick WB.Regulation of MMP-9 expression and activity in the mouse uterus by estrogen［J］.Mol Reprod Dev，2007，74（3）:321-331.

［14］周媛，赵晓晖，陈娟，等.脑白质疏松患者颈动脉斑块稳定性与血清基质金属蛋白酶2及9的关系［J］.中国临床神经科学，2010，18（3）: 252-256.

［15］Ramos-Fernandez M，Bellolio MF，Stead LG.Matrix metalloproteinase-9 as a marker for acute ischemic stroke:a systematic review［J］. J Stroke Cerebrovasc Dis，2011，20（1）:47-54.

［16］李秀玉，王真，李文英.基质金属蛋白酶-9与脑梗死［J］.中国医药学报，2010，7（25）:11-12.

［17］Park KP，Rosell A，Foerch C，et al.Plasma and brain matrix metalloproteinase-9 after acute focal cerebral ischemia in rats［J］.Stroke，2009，40（8）:2836-2842.

［18］Svedin P，Hagberg H，Sävman K，et al.Matrix metallo proteinase-9 gene knock-out protects the immature brain after cerebral hypoxiaischema［J］.J Neurosci，2007，27（7）:1511-1518.

［19］Wadas TM.Emerging inflammatory biomarkers with acute stroke［J］. Critical care nursing clinics of north america，2009，21（4）:493-505.

［20］姚晓利，唐兴江.MMP-2、MMP-9与脑出血的研究进展［J］.西南军医，2010，12（5）:925-927.

Study of the Mechanism of Du Meridian-unblocking and Mind-regulating Acupuncture Pretreatment for Modu-lating miRNA664 and MMP9 in Cerebral Ischemia/reperfusion Rats

ZHENG Shi-ping，HAN Wei，CHU Hao-ran，WANG Ying，ZHANG Ling，ZHANG Guo-qing，ZHU Ling-ling.1.Anhui University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital，Hefei 230061，China

ObjectiveTo investigate the effect of meridian-unblocking and mind-regulating acupuncture pretreatment on neurobehavioral functions and cerebral water content and explore its mechanism for modulating miRNA664 and MMP9 expressions in cerebral ischemia/reperfusion rats.MethodsOne hundred and thirty Wistar rats were randomized into group A（electroacupuncture pretreatment）of 30 rats，group B（moxibustion pretreatment）of 30 rats，group C（aspirin pretreatment）of 30 rats，group D（model）of 30 rats and group E（blank control）of 10 rats.Group A

electroacupuncture；group B，suspended moxibustion with moxa sticks；group C，an oral gavage of aspirin 10 mg/kg.A model of cerebral ischemia/reperfusion was made in every group after seven days.Rat neurobehavioral functions were observed and cerebral water content and relative miRNA664 and MMP9 expressions in the cortical region were determined at 24 hours after reperfusion.ResultsThere was a statistically significant difference in the neurobehavioral score between group A，B，C or D and group E（P＜0.01），between group A or B and group C（P＜0.01）and between groups A and B（P＜0.01）.There were statistically significant differences in cerebral water content and relative miRNA664 and MMP9 expressions between group A，B，C or D and group E（P＜0.01，P＜0.05），between group A，B or C and group D（P＜0.01），between group A or B and group C（P＜0.01，P＜0.05）and between groups A and B（P＜0.01，P＜0.05）.ConclusionsMeridian-unblocking and mind-regulating acupuncture pretreatment can effectively decrease the neurobehavioral score and cerebral water content and reduce relative MMP9 expression through modulating miRNA664 expression in cerebral ischemia/reperfusion rats.One of the mechanisms of Du meridian-unblocking and mind-regulating acupuncture pretreatment for protecting the brain may be reducing relative MMP9 expression，inducing tolerance to cerebral ischemia and relieving cerebral edema by the modulation of miRNA664 expression.

Acupuncture therapy；Unblocking Du meridian and regulating mind；miRNAs；MMP9；Ischemia/reperfusion；Rats；Electroacupuncture

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.01.0076

1005-0957（2016）01-0076-05

安徽省自然科学基金项目（1308085MH174）

郑仕平（1986-），男，住院医师

韩为（1972-），男，主任医师，Email:13956060099@139.com

2015-08-14