中草药与抗生素联用对罗非鱼源无乳链球菌的体外抑菌作用

李焯新，蔡小辉，2，3，黄　瑜，2，3，王　蓓，2，3

（1.广东海洋大学水产学院 // 2.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室 // 3.广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室，广东　湛江　524088）

中草药与抗生素联用对罗非鱼源无乳链球菌的体外抑菌作用

李焯新1，蔡小辉1，2，3，黄瑜1，2，3，王蓓1，2，3

（1.广东海洋大学水产学院 // 2.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室 // 3.广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室，广东湛江524088）

采用琼脂扩散法测定16味中草药水提物和19种抗生素的抑菌活性，筛选出抑菌作用较佳的3味中草药水提物和3种抗生素并测定其最小抑菌浓度（MⅠC），用常量棋盘稀释法测定3味中草药水提物和3种抗生素联用对罗非鱼无乳链球菌的微量抑制浓度指数（FⅠC index），研究中草药与抗生素联用对罗非鱼源无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的体外抑菌效果。结果表明，16味中草药水提物和19种抗生素中，五倍子水提物、黄连水提物对无乳链球菌的体外抑菌作用最强，MⅠC均为3.9μg/mL；其次为板蓝根，MⅠC为250μg/mL；对无乳链球菌抑菌效果较好的抗生素依次为头孢唑林和头孢曲松（MⅠC 0.125μg/mL）、羧苄西林（MⅠC 0.5μg/mL）。联用实验中，黄连与头孢曲松、头孢唑林和羧苄西林联合用药的抑菌作用均表现为协同；五倍子与羧苄西林联合用药的抑菌作用表现为拮抗；板蓝根与3种抗生素联合用药的抑菌作用均为无相关。

罗非鱼；无乳链球菌；中草药；抗生素；微量抑制浓度指数

我国是世界上最大的罗非鱼（Oreochromis）生产国，罗非鱼养殖已成为南方养殖地区的支柱性产业［1］。然而近几年，罗非鱼因感染无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）而暴发传染性疾病，该病传染性强，发病率一般达20%～30%，病鱼死亡率达95%以上，给我国罗非鱼养殖业造成较大的打击，并随着养殖环境的恶化，有不断加剧趋势［2］。目前普遍使用抗生素、化学药物和水体消毒剂防治链球菌引起的疾病，但会给生态环境和人类健康造成影响，长期或过量使用还可能使致病菌产生耐药性。虽然近年来国内水产疫苗有较大的发展，但疫苗的效果受到免疫途径、水体环境、病原的变异和鱼类自身等方面的制约，其在生产上的推广尚需时日［1］；寻找高效的药物来防治该病尤为重要。研究表明，部分中草药与抗生素联用的治疗效果优于抗生素，罗予等［3］指出，黄连合用头孢他啶或头孢噻肟可增强对金葡菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的体外抑菌作用。吴亮等［5］在氟苯尼考分别与大黄、黄连、黄芩、黄柏联用时，34种联用复方对15株鳗鲡（Anguilla japonica）致病菌有协同作用。本研究测定19种抗生素和16种中草药水提物对罗非鱼源无乳链球菌体外抑菌活性，筛选出抑菌效果较好的五倍子、黄连和板蓝根3种中草药，羧苄西林、头孢曲松、头孢唑林3种抗生素进行联合用药试验，研究中草药与抗生素联用对罗非鱼无乳链球菌的抑菌效果，为罗非鱼无乳链球菌病防治提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1药物19种抗生素原粉（表1）均购自Sigma公司，抗生素药敏试纸购自杭州微生物试剂有限公司。中草药原药（表 2）均购自广东省湛江市嘉辉药业有限公司。

1.1.2试验菌株无乳链球菌ZQ0910株分离自广东肇庆罗非鱼产区的患病罗非鱼脑部，由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室鉴定并保存［4］。

1.1.3培养基BHⅠ固体培养基：幼牛脑（提取浸出粉）200g/L，牛心（提取浸出粉）250g/L，葡萄糖 2g/L，氯化钠 5g/L，䏡胨10g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，琼脂18g/L，pH 7.4±0.2。BHⅠ液体培养基：配方同BHⅠ固体培养基不加琼脂。培养基高压灭菌后4℃条件下保存备用。

1.2方法

1.2.1中草药水提物的制备取 16味中草药分别称取50g，用800 mL蒸馏水浸泡2h，武火煮沸后文火煎煮1h，收集药液，过滤，共煎煮2次，合并滤液，蒸发浓缩至50 mL，即得药液质量浓度为1g/mL（以原药计）的中药水提物，以转速4 000r/min离心15min，取上清液用孔径0.22 µm的滤膜过滤除菌，于4℃下保存备用。

1.2.2抗生素原液的制备准确称取各抗生素原粉25.6 mg，加蒸馏水10 mL溶解（即2 560μg/mL），经孔径0.22 µm微孔过滤器过滤除菌，分装至EP管中，- 20℃条件下保存备用。

1.2.3被测菌种活化及悬液的制备在无菌环境下，按体积比1∶100将 - 80℃保存的菌种接种到BHI液体培养基，置37℃下震荡培养16～18h，使菌液浓度为1×108CFU/mL，用BHI液体培养基稀释100倍制成菌悬液备用。

1.2.4抗生素抑菌活性的测定采用琼脂扩散法，吸取1 mL菌液于离心管中，8 000r/min离心1min，弃上清液，用1 mL磷酸缓冲液（PBS）重悬细菌，吸取100 µL菌液均匀涂布于BHI固体培养基，取抗生素药敏试纸贴于培养基表面，每个样品平行 3组，以无菌滤纸（直径为6mm）为空白对照，置于37℃恒温箱培养16～18h后，用游标卡尺测量抑菌圈的直径。选择抑菌效果较好的中草药备用。

1.2.5中草药抑菌活性的测定取无菌滤纸（直径6mm），吸取中草药水提物，吹干后，贴于涂布有菌液的培养基表面。其他操作同1.2.4。选择抑菌效果较好的抗生素备用。

1.2.6筛选出的抗生素及中草药对罗非鱼源无乳链球菌最小抑菌浓度（MIC）测定采用试管二倍稀释法，参照文献［5-6］测定。

1.3数据处理

2　结 果

2.1无乳链球菌ZQ0910对19种抗生素的抑菌活性

19种抗生素对罗非鱼源无乳链球菌的体外抑菌活性见表1。结果表明，大部分抗生素对罗非鱼源无乳链球菌有抑制作用，选取抗菌效果最佳的羧苄西林、头孢曲松和头孢唑林进行联合药敏试验。

2.2无乳链球菌ZQ0910对16种中草药水提物的

抑菌活性

16种中草药水提物对罗非鱼源无乳链球菌的体外抑菌活性见表2。表2可见，仅6种中草药水提物对罗非鱼源无乳链球菌表现出体外抑菌活性，抑菌活性由强至弱的顺序为五倍子、黄连、板蓝根、鱼腥草、金银花和大黄。选取抗菌效果最佳的五倍子、黄连和板蓝根3种中草药进行联合药敏试验。

2.33种抗生素对罗非鱼源无乳链球菌的MIC值

筛选出的3种抗生素最小抑菌浓度（MIC）见表3。表3可见，头孢曲松和头孢唑林的对罗非鱼源无乳链球菌的MIC值均为0.125μg/mL，羧苄西林对该菌的MIC值为0.500μg/mL。

表1　抗生素对无乳链球菌ZQ0910的体外抑菌活性Table 1　Antibacterial activities of antibiotics in vitro against Streptococcus agalactiae ZQ0910

表2　中草药水提物的体外抑菌活性Table 2　Antibacterial activities of Chinese herbs in vitro

表3　3种抗生素对无乳链球菌最小抑菌浓度（MIC）Table 3　MIC of three kinds of antibiotics against Streptococcus agalactiae

2.43种中草药水提物对罗非鱼源无乳链球菌的MIC值

表4可见，黄连和五倍子水提物的MIC值均为3.9μg/mL，板蓝根水提物为250.0μg /mL，表明黄连和五倍子两种中草药的水提物对罗非鱼源无乳链球菌的体外抑菌活性较好。

表4　3种中草药水提物对罗非鱼源无乳链球菌MICTable 4　MIC of three kinds of Chinese herbs against Streptococcus agalactiae

2.53种中草药与3种抗生素联合抑菌试验结果

由表5可见，五倍子水提物、板蓝根水提物与羧苄西林、头孢曲松和头孢唑林联合使用的部分抑菌浓度（FIC）均大于1，表明以上两种中草药与三种抗生素联用对罗非鱼无乳链球菌的体外抑菌作用表现为拮抗作用或无相关作用；而黄连水提物与3种抗生素配伍使用的抑菌效果较单独用药增加，呈现为协同作用。

表5　中草药水提物和抗生素联合的FIC值Table 5　FIC of combined the antibiotic and Chinese herbs against Streptococcus agalactiae

3　讨 论

本研究选用的 16种中草药皆为清热解毒类中草药，其提取物对临床分离罗非鱼源链球菌的抑菌圈直径不同，即对该菌的抑菌活性有差异。这可能是由于不同中草药中含有的单一成分或复合成分的抑菌活性成分不同所造成的。其中以黄连、五倍子和板蓝根抗菌效果较佳，已有研究表明，它们对点状产气单胞菌点状亚种（Aeromonas punctata subsp.Punctata）、苏伯利产气单胞菌（Aeromonas sobria）、鳗弧菌（Vibrio anguillarum）和肠型点状产气单胞菌（Aeromonas punctate）等水生动物常见病原菌均有良好的体外抑菌作用［9］。五倍子的抗菌成分主要是鞣质［10］，对水体中的细菌和藻类具有抑制和杀灭作用［11］； 黄连的主要抑菌成分为小檗碱，是一种常用的广谱抗菌药物，对大部分革兰阴性和革兰阳性菌有抑制作用［12］，并且黄连具有消除 R-质粒作用，可逆转细菌耐药性［13］，本研究中，这两种中草药水提物的抑菌效果良好。然而，板蓝根的抑菌效果却弱于其他两种中草药，由于板蓝根的主要抑菌成分为有机酸，可能本研究使用煎煮法制备的中草药水提物无法将其中的有效成分提取出来，以后的研究中可采取醇提法提取中草药有效成分进行抑菌研究［14］。

本研究通过测量抑菌圈直径初步从 19种抗生素中筛选出3种抑菌效果较好的抗生素进行后续联用试验，所选取的羧苄西林、头孢唑林和头孢曲松均属于β-内酰胺类抗生素，该类药物是通过抑制细菌细胞壁的合成而起到抗菌杀菌作用。其中羧苄西林属于青霉素类，该类抗生素具有全身分布好、对水产动物的毒性低等特点。据倪穗琴等［15］报道，头孢曲松对肺炎链球菌具有良好的体外抗菌活性。但此类抗生素的不足之处在于该类药品的 β-内酰胺环可被β-内酰胺酶水解成为青霉素噻唑酸，易失去抗菌活性。头孢唑林和头孢曲松分别属于第一代和第三代头孢菌素，头孢菌素不仅抗菌谱广、杀菌力强，且对β-内酰胺酶较稳定以及过敏反应少，是常用的广谱抗菌药物。黄勋等［16］研究表明，头孢唑林对金黄色葡萄球菌具有较好的体外抗菌活性。以上研究为后续联用试验提供了试验依据。

本研究选择的黄连水提物与头孢曲松、头孢唑林和羧苄西林联用的FⅠC均为1，表明联用对罗非鱼源无乳链球菌的体外抑菌作用为协同作用，抑菌活性增强，这与杨媛和林彬等［17-18］报道的双黄连与β-内酰胺类联合具有体外协同抗菌作用结果一致。其余中草药水提物与抗生素的配伍联用的FⅠC均大于 1，即体外抑菌作用表现为无相关作用或拮抗作用。上述中草药的研究还存在有未知的有效部位、有效成分及作用机制等不足之处，因此，通过现代药物化学技术对其有效成分进行提取、分离纯化，进一步得到单体化合物，明确中草药的抑菌活性成分，可为研发与β-内酰胺有联合抑菌作用的药物提供理论依据。本研究结果可为罗非鱼无乳链球菌病害防治提供参考，以后将尝试更多的中草药与抗生素配伍联用，为罗非鱼无乳链球菌病害提供更多高效可行的防治途径。

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（责任编辑：刘庆颖）

Antibacterial Effect in vitro on Streptococcus agalactiae Isolated from Tilapia with Combination of Chinese Herbs and Antibiotics

LI Zhuo-xin1，CAI Xiao-hui1，2，3，HUANG Yu1，2，3，WANG Bei1，2，3
（1.Fisheries College，Guangdong Ocean University // 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals // 3.Guangdong Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088，China）

The antibacterial activities of 16 kinds of Chinese herbal medicine and 19 kinds of antibiotics were measured by joan-board diffusion method，and the fractional inhibitory concentrations （FIC index）of S.agalactiae from the combinations of 3 herbal extracts and 3 antibiotics were determined by constant checkerboard test，and the antibacterial activities of the combination of Chinese herbs with antibiotics against Streptococcus agalactiae isolated from tilapia，Oreochromis niloticus，were studied.The results showed that these 16 kinds of herbal medicines and 19 kinds of antibiotics presented good antibacterial effects on S.agalactiae，among them，and both Galla chinensis and Coptis chinensis water extract had the strongest effects of bacteriostasis in vitro，whose MIC were both 3.9μg/mL，followed by Isatis tinctoria with MIC 250μg/mL.Cefazolin and Cephalexin had the strongest effects of bacteriostasis in vitro with MIC 0.125μg/mL，and followed by Carbenicillin （MIC 0.5μg/mL）.Combination of Coptis chinensis with Ceftriaxone，Cefazolin and Carbenicillin had a promoted antibacterial synergy and additive，and combination of，Galla chinensis with Carbenicillin showed antagonism，Radix Isatidis with three kinds of antibiotics showed non-correlation.

Oreochromis niloticus； Streptococcus agalactiae； Chinese herbal medicine； Antibiotic；Fractional inhibitory concentrations （FIC）

S941.42

A

1673-9159（2016）04-0045-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.008

2015-12-22

广东省科技计划项目（2013B020307014），广东海洋大学优秀青年骨干教师特别资助计划（HDYQ2015001）

李焯新（1994－），男，本科，专业方向为水产养殖病害防控。

王蓓（1982－），女，博士，副教授，研究方向为水产经济动物病原生物学。E-mail：wong19820204@126.com