基于cox1和D-loop区序列雷州半岛红树林海区2种野生弹涂鱼的遗传变异

廖　健，贺　亮，张　顺，沈自慧，黄永胜，龙水生，黄承勤，王中铎

（广东海洋大学水产学院，南海水产经济动物增养殖广东普通高校重点实验室，广东　湛江　524025）

基于cox1和D-loop区序列雷州半岛红树林海区2种野生弹涂鱼的遗传变异

廖健，贺亮，张顺，沈自慧，黄永胜，龙水生，黄承勤，王中铎

（广东海洋大学水产学院，南海水产经济动物增养殖广东普通高校重点实验室，广东湛江524025）

设计双层洞穴式弹涂鱼捕捉器，于雷州半岛红树林海区捕获弹涂鱼类野生群体，筛选出弹涂鱼（Periophthalmus modestus）、大弹涂鱼（Boleophthalmus pectinirostris）2个优势种群，并获取其线粒体控制区（D-loop）和cox 1基因部分序列，进行序列变异分析及遗传分析。结果表明，cox 1基因和D-loop区碱基组成A+T含量均大于C+G。cox 1数据揭示，大弹涂鱼变异位点占总长度2.1%，弹涂鱼占2.4%，种内平均遗传距离分别为0.003、0.006，种间遗传距离为0.158，37个个体共定义22个单倍型，单倍型多样性为0.950 45。而D-loop区数据指明，大弹涂鱼变异位点占总长度4.9%，弹涂鱼占7.5%，种内平均遗传距离分别为0.012、0.019，种间距离为0.409，37个个体定义32个单倍型，单倍型多样性水平极高（0.989 49）。中性检验结果显示，2种弹涂鱼进化历程符合中性进化假设，且存在群体扩张的可能。综合cox 1基因和控制区数据显示：弹涂鱼种群遗传多样性高于大弹涂鱼。

红树林；弹涂鱼；捕捉器；序列变异；系统进化

弹涂鱼类（mudskipper）隶属于虾虎鱼科背眼虾虎鱼亚科，我国常见的有大弹涂鱼（Boleophthalmus pectinirostris）、弹涂鱼（Periophthalmus modestus）、青弹涂鱼（Scartelaos histophorus），主要分布于广东、广西、海南等地的河口、潮沟及红树林海区附近滩涂［1］。弹涂鱼类在物种进化上处于极重要位置，是一类进化程度较低的两栖穴居鱼类。弹涂鱼类有较高的经济价值和营养价值，同时是近岸滩涂环境监测的重要指示生物［2］。

细胞色素C氧化酶I（cox 1或COI）基因，是线粒体中为数不多的氨基酸编码基因之一［3］由于其结构简单、分子小、进化速率适中以及遵循母系遗传等特征［4-6］，被用来分析群体间遗传结构及遗传多样性及系统进化关系，逐渐应用于各类物种的分类鉴定。廖健等［7］利用cox 1基因部分序列作为分子标记，分析了雷州半岛红树林区5种虾虎鱼类的系统进化关系，并指出cox 1可用来发现潜在种。线粒体D-loop区又称控制区或D环区，是线粒体中进化速率最快的一段不编码DNA片段，常用于遗传结构分析，在鱼类遗传分析方面，已应用于南海金枪鱼（Thunnus albacares和T.obesus）和大眼鲷（Priacanthus macracanthus）等［8-9］。关于弹涂鱼类的研究主要集中于大弹涂鱼养殖群体，而对于弹涂鱼类野生群体仅见零星的报道［2，10-14］。笔者利用模拟弹涂鱼生境设计的捕捉装置采集野生弹涂鱼类样本，通过获取线粒体cox 1基因和控制区部分序列，分析弹涂鱼类的遗传变异，为雷州半岛弹涂鱼类野生资源的生物学保护和合理开发提供参考。

1　材料与方法

1.1样本的采集

根据弹涂鱼特有的滩涂钻孔栖息习性，模拟其生境，采用塑化玻璃防腐蚀材质制作双层梯形单向通道洞穴式弹涂鱼自动捕捉装置（图1），利用该捕捉器采集弹涂鱼野生群体。2015年11月至2016年3月，于雷州半岛高桥红树林保护区（N21°36'24"，E109°47'8"）捕获弹涂鱼类一批，鲜活运回实验室，经鉴定、筛选，用于群体分析的大弹涂鱼（B.pectinirostris，BP）19尾、弹涂鱼（P.modestus，PM）18尾。

图1　双层洞穴式弹涂鱼捕捉器Fig.1　Double cave mudskipper catcher

1.2DNA提取、cox 1和D-loop扩增及测序

鲜活弹涂鱼样本用体积分数75%酒精处理，剪取肌肉组织约0.5g，采用传统苯酚-氯仿法提取基因组DNA［15］。cox 1基因的扩增引物参照孟玮等［16］，引物正、反向序列分别为：Fish F：5′-TCAACCAAC CACAAAGACAATGGCAC-3′；Fish R：5′-TAGA CTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′。控制区的扩增的正、反向引物为：D-loop F：5′-CCCATCTCT AGCTCCCAAAGC-3′，D-loop R：5′-CTGTAGAGT GAACGCTTGGCATG -3′［17］。引物由上海生工生物有限公司合成。PCR反应体系：10×Buffer（含Mg2+） 2.5μL、2.5 mmol/L Mix dNTP 2μL、5μmol/L引物各1μL、DNA模板1μL、500 u/L Taq DNA聚合酶0.2μL，补充ddH2O至25μL。程序为：94℃ 1min 20 s；94℃ 30 s，T℃ 30 s，72℃ 50 s，30个循环；72℃下延伸5min；4℃下保存，其中cox 1扩增退火温度T为55℃，控制区扩增退火温度T为54℃。PCR扩增用Hema9600扩增仪进行，产物经10 mg/mL琼脂糖凝胶电泳检测，选取条带明亮单一的产物送至上海生工生物有限公司测序。

1.3数据处理

原始序列数据经MEGA6.0多重序列比对、人工核查校正，统计序列基本信息，包括变异位点、单一突变位点、简约信息位点等［18］。碱基组成由MEGA6中Compute Nucleotide Composition计算，Kimura 2-parameter种内、种间遗传距离分别由Within Group Mean Distance和Between Group Mean Distance程序计算。利用Modeltest选择适合进化模式［19］，构建 Neighbor-Joining系统发育树，其中Bootstrap 重复抽样1 000次。单倍型数、单倍型多样性、核苷酸多样度、平均核苷酸差异及中性检验的Tajima's D和Fu's Fs值等遗传多样性参数均由DnaSP v5计算［20］，群体扩张的碱基不配对分布曲线由DnaSP v5中population size change程序完成。最终的序列递交由 Sequin编辑，并 Email至gb-admin@ncbi.nlm.nih.gov获取登录号。

2　结 果

2.1序列多态性分析

Sanger法测序获得的片段经比对剪切后，获得大弹涂鱼cox 1部分序列633 bp，D-loop区部分序列872 bp；弹涂鱼cox 1部分序列634 bp，D-loop区部分序列454 bp；所有序列递交至NCBI，获取登录 号 （cox 1：KX263765-KX263801，D-loop：KX263728-KX263747）。碱基组成如表1。cox 1基因部分序列中，碱基T在密码子的第1、2和第3位具有明显的偏倚性，明显偏向碱基第3位，其中大弹涂鱼A+T含量（56.1%）大于C+G含量（43.9%），弹涂鱼A+T含量（57.2%）亦大于C+G含量（42.8%）。D-loop区部分序列A、T、C、G 4种碱基在密码子的第1、2和3位并未出现明显的偏倚性，大弹涂鱼A+T含量（64.9%）大于C+G含量（35.1%），弹涂鱼A+T含量（64.0%）亦大于C+G含量（36.0%）。经多态性分析，cox 1数据揭示，633 bp的大弹涂鱼cox 1部分序列中，保守位点620个，变异位点13个，变异率为2.1%，简约信息位点5个，单一突变位点8个；634 bp的弹涂鱼cox 1部分序列中，保守位点619个，变异位点15个，变异率为2.4%，简约信息位点9个，单一突变位点6个。D-loop结果表明：872 bp的大弹涂鱼D-loop区部分序列中，保守位点828 bp，变异位点43个，变异率达4.9%，简约信息位点17个，单一突变位点26个；454 bp的弹涂鱼D-loop区部分序列中，保守位点420个，变异位点34个，变异率达7.5%，简约信息位点17个，单一突变位点17个。

表1　基于cox 1基因及控制区部分序列的2种弹涂鱼碱基组成Table 1　Nucleotide composition of 2 species of mudskipper based on cox 1 gene and D-loop region partial sequences %

2.2遗传距离与聚类分析

Kimura 2-parameter模型的种内种间平均遗传距离结果如表2所示：基于cox 1基因部分序列的2种弹涂鱼类种间平均遗传距离为0.158，其中大弹涂鱼种内平均遗传距离为 0.003，弹涂鱼种内平均遗传距离为0.006；而基于D-loop区部分序列的2种弹涂鱼类种间平均遗传距离较cox 1高，为0.409，种间平均遗传也均高于以cox 1基因计算的结果，其大弹涂鱼、弹涂鱼种间平均遗传距离分别为0.012、0.019。以湖栖鳍虾虎鱼（Gobiopterus lacustris）为外群分别构建2种弹涂鱼类cox 1基因和控制区的NJ聚类图（图2），由图2可见，基于cox 1基因及控制区部分片段构建的NJ进化树均聚为2大分类群，且均与外群物种分离。

表2　基于cox 1基因和D-loop的弹涂鱼类种内种间遗传距离Table 2　Intraspecific genetic distance of mudskipper based on cox 1 gene and D-loop region partial sequences

图2　基于cox 1基因（左）及控制区（右）部分序列的构建的2种弹涂鱼NJ聚类树Fig.2　Neighbor-Joining tree of 2 species of mudskipper based on cox 1 gene（left）and D-loop region（right）partial sequences

2.3遗传变异

所统计的遗传多样性参数如表3。37个弹涂鱼个体中，基于cox1基因部分序列共检测出22个单倍型，总单倍型多样性处较高水平（0.950 45），总核苷酸多样度为 0.074 77，总核苷酸差异平均为47.103 60。基于D-loop序列统计的各项遗传多样性参数值多高于cox1基因，37个个体中存在32个单倍型，单倍型比例高达84.5%，总单倍型多样性处极高水平（0.989 49），总核苷酸多样度也较 cox1基因高（0.168 32），总核苷酸差异平均为75.070 57。基于cox 1和控制区部分序列的分析结果均表明，弹涂鱼群体遗传多样性较大弹涂鱼高。

表3　基于cox 1基因及D-loop区部分序列的雷州半岛群体遗传多样性参数Table 3　Parameters of genetic diversity in Leizhou Peninsula populations based on cox 1 gene and D-loop partial sequence

2.4中性检验与群体扩张

中性检验结果显示，Tajima's D和Fu's Fs值均为负数，均不显著，表明2个弹涂鱼类种群在进化上符合中性进化假设。基于cox 1基因和控制区部分序列的2种弹涂鱼群体增长均服从constant模型，核苷酸不配对分布曲线均呈现单峰形（图3），表明2种弹涂鱼类近期可能经历了群体扩张过程。

表4　基于cox 1基因和D-loop区部分序列的中性检验参数Table 4　Parameters of neutrality test based on cox 1 gene and D-loop region sequence

图3　基于cox 1基因及D-loop区序列的2种弹涂鱼mismatch分布分析Fig.3　Mismatch distribution for all pairwise combinations of mitochondrial cox 1 gene and control region data sets of 2 species of mudskipper from Leizhou Peninsula

3　讨 论

3.1cox 1基因和控制区在群体遗传分析上的应用

真核生物线粒体环状DNA上的多个基因或片段根据其变异程度及速率不同而具有不同的遗传分析潜力。例如，较为保守的cox 1、Cyt b、16s rRNA基因除作为Barcoding辅助物种鉴定外，还用于群体系统关系分析。而变异速率较快的控制区（D-loop）则常用于种内群体间遗传多样性分析。李玉龙等［21］利用cox 1基因分析辽宁沿海不同体色花纹的细纹鰤子鱼（Liparis tanakae）二野生群体遗传多样性和遗传结构时表明，cox 1适用于种内遗传分析，也是本研究应用cox 1的原因之一。董丽娜等［22］通过 cox 1基因聚类分析推测日本金线鱼（Nemipterus japonicus）与红棘金线鱼（N.nemurus）为同一物种，而确定苏门答腊金线鱼（N.mesoprion）与日本金线鱼为不同物种，分析三者间的遗传变异时揭示，cox1基因可快速有效地鉴定物种，亦可在一定程度上检测种群间或种群内的变异。线粒体控制区在群体遗传上的应用也受到普遍关注，王中铎等［8］测定南海海域大眼金枪鱼和黄鳍金枪鱼控制区序列，分析了2种金枪鱼的遗传结构，并与GenBank中印度洋、大西洋、太平洋数据比较分析，分析不同海域黄鳍金枪鱼与大眼金枪鱼群体间的基因交流情况及群口扩张。熊丹等［9］利用控制区分析了南海短尾大眼鲷的6个地理群体，发现其间并未出现明显的分化现象。本研究在通过 cox1基因对野生弹涂鱼类进行准确定种基础上，利用 cox1基因分析弹涂鱼、大弹涂鱼的遗传结构，结合控制区分析数据，发现2种弹涂鱼线粒体控制区所检测出的变异位点与保守位点比值均高于 cox1基因，这与彭士明等［3］研究银鲳的养殖与野生群体的结果相似。遗传距离分析表明，基于线粒体控制区的种内种间遗传距离均大于利用 cox1基因所统计的遗传距离值，而基于 cox1基因的弹涂鱼与大弹涂鱼之间遗传距离则较小（0.158），种内遗传距离同样是D-loop区所计算的数值较cox1基因大（表2）。同时，基于线粒体控制区的2种弹涂鱼单倍型数目、单倍型比例、单倍型多样性、核苷酸多样度、平均核苷酸差异均高于 cox1基因（表3）。中性检验表明，2种弹涂鱼均符合中性进化假设，且均经历过群体扩张过程。综上，cox1基因和线粒体控制区均可用于群体遗传分析，但 cox1基因在分析上不及线粒体控制区敏感。

3.22种弹涂鱼类群体遗传特征

大弹涂鱼和弹涂鱼是雷州半岛沿岸广泛分布的2种弹涂鱼类，具有重要的生物进化研究价值和经济价值［23］。本研究中，综合cox1数据与D-loop区结果，2种弹涂鱼中大弹涂鱼遗传多样性水平相对较低，这与金春华等［14］利用RAPD技术研究的结果类似，虽然金春华等早年的研究技术（RAPD）未能从分子水平定量评价大弹涂鱼野生群体的遗传特征，且选择的随机引物数量也极有限，但仍有一定参考价值，笔者对雷州半岛大弹涂鱼线粒体cox1和D-loop区的研究则深入探讨了大弹涂鱼遗传水平，准确地从分子水平定性定量阐述大弹涂鱼种群现状。杨帆等［2］在利用cox1基因作为DNA条形码鉴定弹涂鱼类同时亦指出，我国东南沿海3种弹涂鱼类中，青弹涂鱼（S.histophorus）遗传多样性最低，其次是大弹涂鱼，而弹涂鱼则最高，与本研究结果一致，进一步验证了弹涂鱼遗传多样性高于大弹涂鱼的结果。主要原因可能是，人们对个体大、营养丰富、经济价值高的野生大弹涂鱼种群的捕获量大，加之日益严重的环境问题，导致大弹涂鱼种群数量减少，群体间基因交流减弱，种群退化。

4　结 论

1）cox 1基因和控制区（D-loop）序列均可用于弹涂鱼、大弹涂鱼等鱼类系统发生及遗传分析，但cox 1不及控制区敏感。

2）基于cox 1和控制区（D-loop）的弹涂鱼、大弹涂鱼种群综合分析表明，弹涂鱼遗传多样性高于大弹涂鱼，种群遗传结构较大弹涂鱼稳定。

［1］伍汉霖，钟俊生.中国动物志［M］.北京：科学出版社，2008：1-14.

［2］杨帆，何利军，雷光春，等.中国东南沿海弹涂鱼科常见鱼类的遗传多样性和 DNA条形码［J］.生态学杂志，2012，31（3）：676-683.

［3］彭士明，施兆鸿，侯俊利.基于线粒体D-loop区与COI基因序列比较分析养殖与野生银鲳群体遗传多样性［J］.水产学报，2010，34（1）：19-25.

［4］陈子安，杜晓东，王庆恒，等.3种星虫线粒体 16S rRNA、COI和Cyt b基因片段的序列比较［J］.广东海洋大学学报，2007，27（4）：3-10.

［5］朱惠敏，连一阳，王中铎，等.基于cox1条形码的鱼肚DNA分子鉴定［J］.广东海洋大学学报，2014，34（6）：1-5.

［6］位正鹏，孔晓瑜，吴相云，等.基于 COI序列的翡翠股贻贝 Perna viridis线粒体遗传特性分析及其近缘种间的系统关系探讨［J］.热带海洋学报，2009，28（6）：72-78.

［7］廖健，张顺，龙水生，等.5种虾虎鱼类线粒体COI基因序列变异及系统进化［J］.广东海洋大学学报，2016，36（1） ：7-12.

［8］王中铎，郭昱嵩，颜云榕，等.南海大眼金枪鱼和黄鳍金枪鱼的群体遗传结构［J］.水产学报，2012，36（2）：191-201.

［9］熊丹，李敏，陈作志，等.南海短尾大眼鲷的种群遗传结构分析［J］.南方水产科学，2015，11（2）：27-34.

［10］洪万树，张其永，王明雄，等.人工管道诱导大弹涂鱼产卵研究［J］.热带海洋学报，2001，20（3）：75-80.

［11］张其永，洪万树，陈仕玺，等.潮间带大弹涂鱼产卵习性和自然受精卵孵化研究［J］.热带海洋学报，2006，25（5）：68-73.

［12］刘至治，杨金权，王正琦，等.长江口及其南部邻近地区大弹涂鱼种群遗传结构及种群历史分析［J］.动物学研究，2009，30（1）：1-10.

［13］陈维，洪万树，陈仕玺，等.西北太平洋大弹涂鱼群体遗传结构的 AFLP分析［J］.中国水产科学，2014，25（5）：1020-1028.

［14］金春华，钟爱华，黄福勇，等.大弹涂鱼自然种群遗传多样性的 RAPD分析［J］.海洋科学，2004，28（12）：26-30.

［15］SAMBROOK J，FRITSCH E P，MANIATIS T.Molecular cloning：a laboratory manual［M］.Cold Spring Harbor：Cold Spring Harbor Laboratories Press，1989.

［16］孟玮，杨天燕，海萨，等.基于线粒体 COI基因序列的亚东鲑 DNA条形码研究［J］.水产学杂志，2010，23（1）：2010-2014.

［17］宋娜，宋林，高天翔，等.斑尾复虾虎鱼群体遗传多样性比较分析［J］.水产学报，2011，35（3）：321-326.

［18］TAMURA K.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods［J］.Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.

［19］POSADA D，CRANDALL K A.Modeltest：testing the model of DNA substitution［J］.Bioinformatics，1998，14（9）：817-818.

［20］LIBRADO P，ROZAS J.DNA SP V5：a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data［J］.Bioinformatics，2009，25（11）：1451-1452.

［21］李玉龙，刘俢泽，李轶平，等.基于线粒体 COI基因序列的辽宁沿海细纹鰤子鱼群体遗传多样性分析［J］.海洋渔业，2016，38（2）：120-129.

［22］董丽娜，黄梓荣，艾红，等.北部湾3种金线鱼类COI基因序列的比较分析［J］.中国水产科学，2011，18（3） ：508-514.

［23］王从涛.中国沿海大弹涂鱼群体的亲缘地理与种群遗传结构分析［D］.上海：上海海洋大学，2013.

（责任编辑：刘庆颖）

Genetic Variation of 2 Wild Mudskipper Populations from Mangroves of Leizhou Peninsula Based on cox 1 Gene and Control Region

LIAO Jian，HE Liang，ZHANG Shun，SHEN Zi-hui，HUANG Yong-sheng，LONG Shui-sheng，HUANG Cheng-qin，WANG Zhong-duo
（Key Laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic Economic Animal of Guangdong Higher Education Institutes，Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China）

Double-cavern trap were designed to capture wild mudskipper populations that could screen Periophthalmus modestus and Boleophthalmus pectinirostris populations to analyze sequence variation and genetic structure based on mitochondrial control region （D-loop） and cox 1 gene sequence.The results showed that base composition of A + T was greater than that of C + G，which occurred on both cox 1 gene and the D-loop region.The data of cox 1 revealed 2.1% variation sites of B.pectinirostris，while P.modestus hold 2.4%.The average genetic distance of intraspecific was 0.003，0.006，respectively，and the interspecific was 0.158.Besides，37 individuals defined a total of 22 haplotypes based on cox 1 gene，while haplotype diversity was 0.950 45.The data of D-loop region indicated that B.pectinirostris hold 4.9% variation sites of the total length and P.modestus had 7.5%.The average genetic distances of intraspecific and interspecific were 0.012，0.019 and 0.409，respectively.Furthermore，37 individuals contained 32 haplotypes based on D-loop region.Haplotype diversity was at a very high level （0.989 49）.Neutral test results showed that evolution hypothesis of the two kindsmudskippers were consistent with neutral evolution，and population expansion might exist.Considering all these facts，it can be inferred that the genetic diversity of P.modestus was higher than B.pectinirostris.

Mangroves；mudskipper；trapper；Sequence variation；Phylogenetic

S917.4

A

1673-9159（2016）04-0006-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.002

2016-05-28

广东海洋大学“海之帆—起航计划”大学生科技创新项目（hzfqhjhkjfm2015b11）；广东海洋大学优秀学位论文培育项目（201605）；国家自然科学基金项目（31201996）

廖健（1990－），男，硕士研究生，从事南海经济鱼类系统进化研究。E-mail：liaojiancc@foxmail.com

王中铎（1980－），男，副教授。E-mail：aduof@gmail.com