眼斑拟石首鱼烂尾病病原菌的分离鉴定及灭活疫苗的免疫效果

姚　欢，黄郁葱，蔡双虎，鲁义善，蔡小辉，简纪常

（（1.广东海洋大学水产学院 // 2.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室 // 3.广东高等学校水产经济动物病害控制重点实验室，广东 湛江 524088；4.广西海洋研究所 // 5.广西海洋生物技术重点实验室，广西 北海 536000）

眼斑拟石首鱼烂尾病病原菌的分离鉴定及灭活疫苗的免疫效果

姚欢1，2，3，黄郁葱1，2，3，蔡双虎1，2，3，鲁义善1，2，3，蔡小辉4，5，简纪常1，2，3

（（1.广东海洋大学水产学院 // 2.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室 // 3.广东高等学校水产经济动物病害控制重点实验室，广东 湛江 524088；4.广西海洋研究所 // 5.广西海洋生物技术重点实验室，广西 北海 536000）

从患烂尾病眼斑拟石首鱼（Sciaenops ocellatus）的溃疡处分离到一株优势菌SoGZ1401，回归感染试验证实该菌是引起烂尾病的病原菌，对眼斑拟石首鱼的半致死量（LD50）为8.6×103CFU·g-1；结合其形态学和生理生化特征及HSP60测序分析，鉴定为哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）；利用杯碟法研究其胞外产物性质，结果表明：其胞外产物具有淀粉酶、明胶酶、酪蛋白酶、卵磷脂酶、脂酶活性以及溶血活性，但无脲酶活性。药敏试验表明，该菌株对氟哌酸、恩诺沙星、氟苯尼考和复方新诺明等抗菌药有较高的敏感性。制备哈维氏弧菌灭活疫苗，采用注射和浸泡2 种途径免疫眼斑拟石首鱼，测定受免疫鱼的血清抗体效价和疫苗对眼斑拟石首鱼的免疫保护率。结果显示，免疫组血清中的抗体效价水平均高于对照组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），注射组和浸泡组的抗体效价最高值分别达718.4和128，哈维氏弧菌攻毒后免疫保护率分别为75.0%～86.7%和46.4%～56.7%。哈维氏弧菌灭活疫苗对眼斑拟石首鱼具有较好的免疫保护性。

眼斑拟石首鱼；烂尾病；病原；哈维氏弧菌；免疫效果

眼斑拟石首鱼 （Sciaenops ocellatus）俗称美国红鱼（red fish）、红鼓（red drum）、红拟石首鱼、斑尾鲈（spot-tail bass）和海峡鲈（channel bass）等，属鲈形目石首鱼科拟石首鱼属，系溯河性、广温、广盐鱼类。我国于1991年引种试养，1995年种苗繁育成功并开始养殖，因其生长速度快、产量高、抗逆力强和经济价值较高，目前已成为我国南方和北方部分地区池塘和网箱养殖的重要鱼种［1］。但由于近年来养殖集约化程度逐渐提高，近海环境污染严重，养殖海域环境恶化，养殖过程中病害日益增多，先后分离和鉴定的病原有虹彩病毒［2］、海藻施万氏菌（Sheumatella relgae）［3-4］、河流弧菌（Vibrio fluvialis）［5］和海豚链球菌（Streptococcus iniae）［6］等。2013年12底至2014年2月初，湛江港养殖海域的眼斑拟石首鱼暴发严重的烂尾病，病鱼发病初期尾部体表轻微充血发炎，随着病程的发展，鳞片脱落，皮肤溃烂，充血发红，严重时肌肉和骨骼外露甚至断尾。该病传染速度快，死亡率为 50% ～80%，给养殖户造成巨大损失，确定病原和有效的防治措施对该病防控有重要意义。本研究对该病原菌进行了分离和生理生化鉴定，并制备灭活疫苗，为眼斑拟石首鱼的病害防治提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

眼斑拟石首鱼病鱼取自湛江某养殖网箱，有典型病征，体质量20～30g；健康鱼体质量35g，购自湛江某育苗场，于水泥池中暂养7 d后用于试验。暂养水温25～29℃，每天早上投饵和换水1次，24h充气。

新型微生物微量生化鉴定盒购自广东环凯微生物科技有限公司，Biolog GN2 Microplate购自美国 Biolog 公司（Biolog Inc.Hayward，CA，USA），药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司，Gel Extraction Kit 购自Omega公司。

1.2细菌的分离

取濒死病鱼，从溃疡部位挑取少量组织，接种于TSA和TCBS培养基平板，于28℃条件下培养24h后，挑取优势菌落于TSA培养基平板反复划线分离纯化，直至获得纯培养物，接种于胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic Soy Broth，TSB），培养12h后加入1/5体积的甘油，保存于- 80℃。

1.3致病性试验

1.3.1分离菌株浸泡感染将分离菌株在 TSB培养12h后，用沙滤海水稀释为2×107CFU·mL-1，分别浸泡感染健康、刮去几片鳞片和剪去部分尾鳍的眼斑拟石首鱼各 20尾，同时设不经菌浴的对照组，浸浴24h后分别饲养于玻璃钢养殖桶中，试验期间水温25～30℃，每天早上投饵和换水1次，24h充气，连续观察14 d，记录鱼体发病死亡情况，及时去除死鱼。

1.3.2分离菌株注射感染将分离菌株在 TSB扩大培养12h后，用无菌磷酸缓冲液PBS（pH7.2）稀释为1×108CFU·mL-1，分别肌肉和腹腔注射感染健康眼斑拟石首鱼20尾，每尾鱼注射0.1 mL，对照组注射等量无菌PBS。

取因感染而病死的眼斑拟石首鱼，于病灶处分离细菌（无菌操作），接种于TSA培养基，取单菌落重复划线纯化并鉴定。

1.4半致死量（LD50）的测定

将 1×108、1×107、1×106、1×105、1×104CFU·mL-1等 5个浓度梯度的菌悬液分别腹腔注射健康眼斑拟石首鱼，每个浓度梯度 10尾，每尾鱼注射0.1 mL，以注射等量无菌磷酸缓冲液PBS（pH 7.2）的健康眼斑拟石首鱼10尾作对照，注射后的眼斑拟石首鱼分别饲养于玻璃钢养殖桶，水温25～30℃，每天早上投饵和换水1次，24h充气，连续观察14 d，用改良寇氏法计算半数致死量LD50。

1.5分离菌株胞外产物分析

挑取单菌落接种于TSA斜面，活化18h，用PBS（pH 7.2）洗下，取菌悬液涂于铺有无菌玻璃纸的TSA平板上，于28℃条件下培养24h，每培养皿中加入PBS 5 mL将菌洗入无菌三角瓶中，用磁力搅拌器搅拌30min，在4℃、12 000g条件下离心20min，除去菌体，上清液经孔径0.22μm的纤维素膜过滤，滤液置4℃下保存待用。用杯碟法分析胞外产物活性［7］。

1.6细菌的形态特征及鉴定

参照东秀株等［8］和伯杰氏细菌鉴定手册［9］的方法对分离菌株进行常规生理生化反应鉴定，同时应用Biolog公司的革兰阴性细菌鉴定板进行95种唯一碳源的生化反应鉴定，用 Biolog MicroStation System 3450 软件分析结果。

1.7系统发育学分析

分离菌株基因组的提取和HSP60基因PCR扩增参考东秀株等［8］和 Kwok［10］方法。扩增的正向引物：5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAIIII CGIGGIGA（TC）GGIACIACIAC-3′（记作H279MT），反向引物：5′-CAGGAAACAGCTATGACCGGATC C（TC）（TG）I（TC）（TG）ITCICC（AG）AAICCIGGIGC（T C）TT-3′（记作 H280MT）。PCR反应体系：ExTaq DNA聚合酶（5 U·μL-1，含Mg2+）0.5μL，dNTP 4μL，10×PCR缓冲液5μL，正反向引物（10μmol·L-1）各1μL，DNA模板2μL，加超纯水至总体积50μL。PCR反应条件：94℃ 4min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共32个循环；72℃下延伸5min。PCR产物采用Gel Extraction Kit回收，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果经Blast分析后，选取GenBank中所获的弧菌属相关标准菌株运用 Clustalx软件进行同源性分析，最后用Mega5.0软件采用邻接法（Neighbor-joining）构建系统进化树，自展数为1 000次。

1.8药敏试验

采用WHO推荐的K-B法（纸片扩散法）进行。将分离菌株培养6h后，将菌液浓度调整至1.5×108CFU·mL-1，均匀涂布于MHA培养基平板上，当平板上的水分被琼脂完全吸收后贴上药物试纸片，经28℃恒温培养24h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，根据产品说明书标准判定待测菌株对药物的敏感程度。

1.9疫苗制备与免疫

将分离菌株SoGZ1401接种于TSB培养基中，以28℃、180r/min条件振荡培养16h，将培养液进行梯度稀释后用平板计数法测定培养液的活菌数，加入体积分数0.4%福尔马林于28℃下灭活48h，用 PBS洗涤 3次，将菌液浓度调整为 1×109CFU·mL-1，然后进行无菌检验和安全检验。安全检验方法为将制备的疫苗注射30～40g健康眼斑拟石首鱼20尾，0.2 mL/尾，连续观察14 d，试验鱼应健康、活力好、无异常行为，表明疫苗灭活彻底。免疫试验设对照组、注射组和浸泡组3组，每组鱼100尾，对照组不做任何处理；注射组首次免疫腹腔注射疫苗0.2 mL，14 d后以相同剂量再次注射免疫；浸泡组于含浓度1×108CFU·mL-1疫苗的海水中充气浸泡接种30min，14 d后以相同浓度再次浸泡免疫。

1.10采血、抗体效价测定与免疫保护效果评价

首次免疫后每周采血1次，连续8周，每次每组随机捞取5尾免疫鱼尾静脉采血，于室温下静置2h，以4 000r/min离心10min，收集血清，于- 20℃条件下保存备用。按陈贺等［11］方法，采用96孔V型血凝板来测定各组免疫血清的凝聚效价。免疫后的第8周，分别从每组随机捞取鱼20尾，以2×LD50浓度腹腔注射，攻毒后分别饲养于玻璃钢养殖桶，水温25～30℃，每天早上投饵和换水，24h充气，连续观察14 d，每天记录试验鱼的发病与死亡情况，并对发病鱼进行病原菌分离鉴定。计算鱼的免疫保护率（RPS）：

相对免疫保护率=（1-免疫组死亡率/对照组死亡率） ×100%

2　结 果

2.1病原菌及形态特征

从患病鱼溃疡处分离到一株优势菌株，命名为SoGZ1401，人工感染的濒死病鱼内脏分离得到的优势菌株命名为AiSo。分离菌株在28℃条件下培养24h后，在TSA培养基上菌落圆形，表面光滑，边缘整齐，淡黄色，直径约1.5～2.5mm；在TCBS上培养基上菌落呈黄色，直径2.0～3.5mm。革兰染色阴性，短杆状，两端钝圆，具一极生单鞭毛，用水浸片检查和半固体穿刺培养，发现SoGZ1401菌有运动能力。

2.2致病性试验

致病性试验结果见表1。表1可见，刮鳞后菌浴和剪尾后菌浴均可使鱼感染发病，刮鳞后菌浴和剪尾后菌浴分别于感染后4 d和5 d时开始出现死亡，至14 d时死亡率分别为75%和65%，对照组无死亡，发病鱼的症状与自然感染发病鱼相似，尾鳍充血发红，之后发生溃烂死亡。肌肉和腹腔注射感染，鱼在2 d内全部死亡，死亡率100%，对照组无死亡，从病鱼病灶处再次分离的菌株经鉴定后表明为同一种菌，故确定SoGZ1401菌株为本次眼斑拟石首鱼烂尾病的病原菌。

表1　人工感染试验结果Table 1　Result s of artificial infection test

2.3半数致死量（LD50）

根据致病性结果测定的 LD50见表 2，计算得SoGZ1401菌株的LD50为8.6×103CFU·g-1，其95%可信限为2.7×103～ 2.8×104CFU·g-1。根据Devesa对鱼类致病菌毒力的划分标准［12］，可判定该菌具有较强的毒力。

2.4胞外产物

测定SoGZ1401胞外产物的酶活性如表3。表3可见，该细菌胞外产物有明胶酶、淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶、卵磷脂酶等多种酶活性，但未检测到脲酶活性。相同体积胞外产物提取液中，明胶酶、淀粉酶的活性最高；其次是酪蛋白酶、脂肪酶，卵磷脂酶的活性较低。此外，该菌株对眼斑拟石首鱼的红细胞具有一定的溶解能力。

表2　SoGZ1401对眼斑拟石首鱼的半数致死量Table 2　LD50 of SoGZ1401 to S.ocellatus

表3　胞外产物的酶活性Table 3 The enzymatic activities of ECP of SoGZ1401

2.5细菌生理生化特性

SoGZ1401菌株生理生化特性见表4。表4显示，菌株SoGZ1401革兰阴性，氧化酶阳性，4℃以下和42℃以上皆不生长，无盐不生长，在80g/L 以上NaCl胨水中不生长，O/129（10和150 µg·片-1）敏感，还原硝酸盐，含赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶，不含精氨酸脱羧酶和双水解酶，发酵葡萄糖产酸不产气，MR、V-P阳性，利用水杨素、葡萄糖、蔗糖、纤维二糖、麦芽糖、甘露糖等糖类，不利用阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、乳糖等糖类，与文献［8-9］对哈维氏弧菌描述基本一致；Biolog系统软件分析表明，与哈维氏弧菌（V.harveyi）标准株的相似性高达99%，相似率为0.745（最大相似度为1.000）。结合生理生化特性和 Biolog系统鉴定结果，将SoGZ1401菌鉴定为哈维氏弧菌。

2.6系统发育树

为进一步确定该分离菌株SoGZ1401的分类地位，测定其HSP60的部分序列，经Blast比较，发现SoGZ1401序列与哈维氏弧菌同源性高达99.9%。根据SoGZ1401与相关属种HSP60基因序列构建系统发育树见图1。图1可见，SoGZ1401与哈维氏弧菌自然聚为一支，说明与哈维氏弧菌亲缘关系最近，可将SoGZ1401进一步确认为哈维氏弧菌。

表4　分离菌株和哈维氏弧菌的生理生化特性Table 4　Physiological and biochemical characters of SoGZ1401 strain and V.harveyi

2.7药敏试验结果

SoGZ1401对24种药物敏感性试验结果见表5。表5表明，分离菌株SoGZ1401对青霉素G、阿莫西林、先锋V、氨苄青霉素、头孢噻吩、卡那霉素、新生霉素、多黏菌素B、呋喃唑酮、万古霉素和林可霉素等耐药；对庆大霉素、四环素、红霉素、利福平、链霉素等中度敏感；对复方新诺明、诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星和氟苯尼考等高度敏感。

2.8血清抗体效价测定和疫苗保护试验结果

免疫鱼血清抗体效价如图2所示。图2表明，抗体效价在免疫后均呈现明显的升高趋势，免疫组与对照组差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。免疫 1周后可检测到抗体，注射组和浸泡组抗体效价分别在免疫后4周和5周时达到高峰，分别为718.4和128，之后逐渐下降，至8周时，免疫组的抗体效价均在32以上。从表6可见，免疫接种后，注射组和浸泡组均获得一定的免疫保护力，其免疫保护率分别为75.0%～86.7%和46.4%～56.7%。

图1　基于HSP60序列的系统发育树Fig.1　Phylogenetic tree based on HSP60 sequences

表5　病原株SoGZ1401的药敏试验结果Table 5　Result of drug sensitivity test on the pathogen strain SoGZ1401

图2　免疫鱼的抗体效价Fig.2　Antibody titers of vaccinated fish

表6　分离菌株疫苗免疫后眼斑拟石首鱼的免疫保护率Table 6　RPS of S.ocellatus immunized with the V.harveyi vaccine

3　讨 论

哈维氏弧菌是引起多种海水养殖鱼类疾病的重要病原菌，导致台湾地区军曹鱼（Rachycentron canadum L.）［13］以及我国大陆养殖花鲈（Lateolobrax japonicus）［14］、大黄鱼（Pseudosciaena crocea）［15］、斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）［16-17］、青石斑鱼（E.awoara）［18］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［19］和鮸鱼（Miichthys miiuy）［20］暴发弧菌病，可引起病鱼溃疡和内部器官病变，最终导致死亡。本研究通过回归感染试验和生化鉴定确认病原为哈维氏弧菌，与大黄鱼［15］和斜带石斑鱼［16-17］烂尾病的报道一致。哈维氏弧菌引起眼斑拟石首鱼暴发烂尾病尚属首次报道，可见随着养殖业集约化进一步发展和海水养殖环境的日益恶化，哈维氏弧菌已经成为目前危害我国海水养殖鱼类的主要病原菌。

哈维氏弧菌作为一种条件致病菌，在一定条件下通过水产动物伤口或消化道感染［20］。范文辉等［19］发现，大菱鲆溃疡病的发生与寄生虫感染密切相关，本研究表明，所分离菌株可通过创伤感染眼斑拟石首鱼，感染后死亡率高。因此，在眼斑拟石首鱼的运输或养殖过程中，应尽量避免受伤，同时需做好寄生虫的防治工作，以减少发病机率。

弧菌胞外产物是一类重要的毒力因子［20-23］，包含外毒素和各种酶，在致病过程中发挥重要作用。Saeed等［24］发现哈维氏弧菌的胞外产物对棕点石斑鱼（E.tauvina）具有较强的毒性，Liu等［25］发现，来源于斑节对虾（Penaeus monodon）的病原哈维氏弧菌胞外产物具有蛋白酶、磷脂酶和溶血素等。本研究中，烂尾病病原菌SoGZ1401胞外产物同样含有脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、明胶酶及溶血素等成分，这与Liu等［25］和白方方等［26］的报道基本一致。因此，病原哈维氏弧菌可通过产生大量蛋白酶和外毒素，直接破坏宿主组织的结构和功能，溶血素又能使鱼的血细胞溶解，从而促进病原菌的定殖、扩散和侵染，随着时间的延长，机体最终衰竭死亡。

目前我国在水产养殖疾病防治时普遍使用抗生素，一定程度上导致养殖环境中病原弧菌耐药菌的种类和数量增加，同时危害水产品质量安全和人类身体健康［27］。最近检测发现，我国地表水含有68种抗生素且浓度较高，其中部分来源于养殖业［28］，须对环境的抗生素污染保持高度警惕。本研究表明，分离菌株SoGZ1401仅对喹诺酮类药物氟哌酸、氧氟沙星、恩诺沙星和磺胺类药物复方新诺明以及氟苯尼考敏感，对其他药物有抗性，呈现多重耐药，因此，应该选用敏感药物防治眼斑拟石首鱼烂尾病，防止滥用药物导致细菌耐药性日益增强以及对微生物生态的破坏。此外，还可通过疫苗、有益微生物和生态防病等综合措施防控疾病。

使用疫苗是水生动物疾病防控的重要手段。沈锦玉和毛芝娟等［29-30］研制哈维氏弧菌灭活疫苗，运用注射和浸泡免疫方式免疫大黄鱼，发现受免疫鱼抗体效价和存活率有较大提高。本研究中将哈维氏弧菌灭活疫苗运用注射和浸泡免疫方式接种眼斑拟石首鱼，注射免疫组和浸泡免疫组的抗体水平均有显著提高，注射免疫组保护率高于浸泡免疫组，可见哈维氏弧菌疫苗通过腹腔注射和浸泡免疫眼斑拟石首鱼后均可刺激机体产生明显的体液免疫应答，而且免疫组血清抗体水平与保护率存在一定的相关性，这与沈锦玉等［29］和毛芝娟等［30］的研究结果相一致。虽然注射免疫的免疫保护效果优于浸泡免疫，但注射免疫工作量大，操作繁琐，而且易造成鱼体应激和受伤，在养殖生产上受到一定限制。浸泡免疫操作较方便，对鱼体应激较小，可对大批量幼鱼进行免疫。因此可进一步探讨浸泡免疫和注射免疫途径相结合的免疫接种程序，即育苗期可采用浸泡免疫，而对鱼种进行注射免疫，以提高疫苗免疫保护率和延长保护时间，推动渔用疫苗的实用化研究和生产应用，保障水产养殖业的健康发展。

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（责任编辑：刘庆颖）

Isolation and Identification of Bacterial Pathogens from Sciaenops ocellatus with Tail-rotted Disease and Evaluation of Immune Efficacy of Inactived Vaccine

YAO Huan1，2，3，HUANG Yu-cong1，2，3，CAI Shuang-hu1，2，3，LU Yi-shan1，2，3，CAI Xiao-hui4，5，JIAN Ji-chang1，2，3
（1.Fisheries College of Guangdong Ocean University // 2.Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals of Guangdong // 3.Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institute，Zhanjiang 524088，China； 4.Guangxi Key Laboratory of Marine Biotechnology //5.Guangxi Institute of Oceanology，Beihai 536000，China）

A dominant bacterial strain designated as SoGZ1401 was isolated from ulcer of the moribund Sciaenops ocellatus with rotted-tail disease and was confirmed to be the pathogen by artificial infection test.The 50% lethal dose of SoGZ1401 to the S.ocellatus was 8.6×103CFUg-1.The strain SoGZ1401was identified as Vibrio harveyi based on morphology，physiological & biochemical tests and HSP60 DNA sequence analysis.The extracellular products of V.harveyi strain were studied by cylinde-plate method.The results indicated that the extracellular products show the activities of amylase，gelatinase，casease，lipase，lecithinase and haemolysin，but without urease activity.Drug sensitivity tests revealed that V.harveyi strain was sensitive to norfloxacin，Enrofloxacin，Florfenicol and compound sulfamethoxazole.The vaccine was prepared with formalin-inactivated strain SoGZ1401 to study antibody titer and immune efficacy on S.ocellatus.The vaccination was administered by intraperitoneal injection and bath immersion route.Antibody titer in the serum of the injected group and immersion group were significantly increased compared with the control group and the maximal titers reach 718.4 and 128，respectively.The Relative Percentage Survival （RPS） values of the injected group and immersion group were 75.0% - 86.7% and 46.4% - 56.7%，respectively.It is concluded that S.ocellatus can produced strong immune response immunized with V.harveyi bacterin，and the vaccine provide good protection efficiency against bacterial disease cause V.harveyi.

Sciaenops ocellatus； tail-rotted disease； pathogen； Vibrio harveyi； immune efficacy

S941.42； S942.5

A

1673-9159（2016）04-0037-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.007

2016-01-17

广东省海洋经济创新发展区域示范专项（GD2012-B01-004）；广西海洋生物技术重点实验室开放基金 （GLMBT-201404）； 农业部农业公益项目（201203085）；广东省科技计划项目（2012020800006）

姚欢（1987－），硕士生，从事水产动物病害防治研究。E-mail：yaohhmail@163.com

黄郁葱（1978－），男，助理研究员，博士，从事水产动物免疫学及病害控制。E-mail：hyczjou@163.com