牛型纯化蛋白衍生物皮内变态反应试验阳性牛中分枝杆菌的分离与鉴定

王曲直，江渊，沈素芳，沈鑫，赵洪进，唐文红，徐峰，杨显超，刘佩红

1.上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103； 2.上海市疾病预防控制中心，上海 200336



·论著·

牛型纯化蛋白衍生物皮内变态反应试验阳性牛中分枝杆菌的分离与鉴定

王曲直1，江渊2，沈素芳1，沈鑫2，赵洪进1，唐文红1，徐峰1，杨显超1，刘佩红1

1.上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103； 2.上海市疾病预防控制中心，上海 200336

为评价牛分枝杆菌纯化蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)单纯颈部皮内变态反应试验(single intradermal cervical tuberculin，SICT)在奶牛结核病检测中的特异性，采集54头SICT阳性牛的118份组织样品进行病原分离和鉴定。结果显示，14头SICT阳性牛样品中分离到抗酸阳性菌，占SICT阳性牛总数的25.9%(14/54)。其中，10头阳性牛样品中分离到分枝杆菌，占18.5%(10/54)；1头阳性牛样品中分离到牛分枝杆菌，占1.9%(1/54)。从118份组织样品中分离到16株抗酸阳性菌，其中12株为分枝杆菌，分枝杆菌分离率为10.2%(12/118)。12株分枝杆菌中，1株为牛分枝杆菌，其余11株为禽分枝杆菌、土地分枝杆菌等非结核分枝杆菌。牛分枝杆菌与非结核分枝杆菌分别占分枝杆菌分离株的8.3%(1/12)和91.7%(11/12)。病原分离和鉴定结果表明，SICT阳性牛的牛分枝杆菌分离率较低，为确保检测结果的准确性，有必要采用其他检测方法进行验证。同时，可将分枝杆菌快速分离培养及菌种鉴定检测技术引入对皮内变态反应试验阳性牛的实验室诊断，进一步提高牛结核病检测的特异性。

皮内变态反应试验；阳性牛；分枝杆菌

牛结核病是一种主要由牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis，M.bovis)引起的慢性消耗性人兽共患传染病，对养牛业发展、奶产品安全及人类健康有重大威胁[1]。中国是全球结核病高负担国家之一，2000年第4次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，全人口的结核分枝杆菌感染率为44.5%[2]。世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties，OIE)推荐的牛结核病检测方法有皮内变态反应试验、γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)试验等[1]。目前，我国普遍采用牛分枝杆菌纯化蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)进行单纯颈部皮内变态反应试验(single intradermal cervical tuberculin，SICT)开展检测，比较颈部皮内变态反应试验(single intradermal comparative cervical tuberculin,SICCT)和IFN-γ试验也逐步用于确诊。多年来，SICT在牛结核病的监测中发挥了重要作用，但在实际工作中也出现假阳性率高、重复性差等问题。本研究对奶牛结核病监测中的SICT阳性牛采集组织样本进行病原分离和鉴定，以了解上海地区奶牛场分枝杆菌感染情况。

1　材料与方法

1.1主要试剂与仪器

国产牛型PPD购自哈药集团生物疫苗有限公司，进口牛型PPD和禽型PPD、BOVIGAM®牛结核分枝杆菌IFN-γ检测试剂盒购自瑞士Prionics公司，BACTEC MGIT 960 System、MGIT 7 mL分枝杆菌生长指示管、MGIT TBc Identification Test(结核分枝杆菌复合群鉴定试剂)、MGIT 960 SIRE 试剂盒、MGIT 960 PZA(吡嗪酰胺)药敏培养管及PZA药敏试剂盒购自美国BD公司，3130基因分析仪及相应试剂购自美国Applied Biosystems公司，抗酸染色液购自珠海贝索生物技术有限公司，中性罗氏培养基及对硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid，PNB)、噻吩-2-羧酸酰肼(2-thiophenecarboxylic acid hydrazide，TCH)含药培养基由上海市疾病预防控制中心培养基室提供。

1.2试验用牛

在5个奶牛场开展试验。这些奶牛场每年上、下半年各进行一次SICT全群监测，对检出的阳性牛进行扑杀和无害化处理。

1.3SICT和IFN-γ试验

5个奶牛场均采用SICT进行全群检测。对D奶牛场检出的SICT阳性牛，在扑杀采样前用SICCT和IFN-γ试验进行复核检测。SICT、SICCT和IFN-γ试验按王曲直等的方法进行[3]。SICT采用国产牛型PPD，SICCT采用进口牛型PPD和进口禽型PPD。使用剂量为：国产牛型PPD 2 000 IU，进口牛型PPD 3 000 IU，进口禽型PPD 2 500 IU。SICT参照《动物结核病诊断技术(GB/T18645-2002)》进行操作和判定，SICCT参照OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》中牛结核病诊断方法进行操作和判定[1]。IFN-γ试验采集试验牛血液，按试剂盒说明书进行操作和判定。

1.4样品采集

采用简单随机抽样法，自SICT阳性牛无菌采集淋巴结、肺等组织样品。

1.5病原菌分离和鉴定

按江渊等建立的快速检测方法，采用MGIT 960液体培养法对样品组织中分枝杆菌进行快速分离培养，采用免疫色谱法和基因测序进行快速基因分型及菌种鉴定[4]。针对结核分枝杆菌复合群内不同菌种基因组中6个差异基因片段的存在和缺失不同，参照相关文献进行引物合成和结核分枝杆菌复合群菌种鉴定[5]。差异基因片段的扩增结果结合牛分枝杆菌对吡嗪酰胺天然耐药而对其他抗结核药物敏感，从而鉴定牛分枝杆菌。经MGIT TBc Identification Test初筛鉴定为非结核分枝杆菌(nontuberculousMycobacterium，NTM)的抗酸阳性菌，用16S rRNA基因序列分析进行菌种鉴定。

2　结果

2.1SICT结果

5个奶牛场总存栏量9 355头，试验历时3年，共开展6次SICT全群监测，共检出SICT阳性牛223头。

2.2SICCT和IFN-γ试验结果

D奶牛场共检出SICT阳性牛26头，采用简单随机抽样法抽取10头SICT阳性牛，用SICCT和IFN-γ试验复核检测。10头SICT阳性牛中，SICCT检出阳性牛4头，IFN-γ试验检出阳性牛1头。结果见表1。

表1SICCT和IFN-γ检测结果

Tab.1Results of SICCT and IFN-γ test

IFN-γPositiveNegativeTotalSICCTPositive044Negative156Total1910

2.3采样情况

无菌随机采集5个奶牛场54头SICT阳性牛的淋巴结组织、肺组织、血液、乳汁等样品共118份，每头牛至少采集肺组织样品或肺淋巴结组织样品1份以上，具体样本组成见表2。病理解剖均未见明显肉眼观病变。

表2不同组织的分枝杆菌分离率

Tab.2Isolation rate ofMycobacteriain different tissues

TissuenIsolatedstrainIsolationrate(%)Pulmonarylymphnode44511.4Lung20210.0Mesentericlymphnode10110.0Intestine200Axillarylymphnode200Spleen11100Wholeblood2700Milk12325.0Total1181210.2

2.4组织样品分离培养结果

118份样品经前处理后，进行MGIT 960分离培养和中性罗氏分离培养，培养阳性物经涂片抗酸染色确认为抗酸阳性菌的样品共16份，来自4个奶牛场的14头SICT阳性牛。16株抗酸阳性菌中，分枝杆菌共12株，来自10头SICT阳性牛。16份抗酸阳性菌样品经MGIT TBc Identification Test初筛鉴定，有1株为结核分枝杆菌复合群，来自1头SICT阳性牛的肺淋巴结样本。分枝杆菌MGIT液体培养阳性报告时间为17 d，转种中性罗氏培养基，生长28 d后呈典型的象牙色、表面干燥、粗糙的菌落形态(图1)。其余15株均为NTM或其他抗酸阳性菌，来自13头SICT阳性牛。从不同组织的分枝杆菌分离率来看，牛奶和肺淋巴结的分离率较高，分别为25.0%和11.4%。未在血液中分离到分枝杆菌。因仅有1份脾脏组织，故未将其纳入统计。不同组织的分枝杆菌分离率见表2。

图1培养阳性的结核分枝杆菌复合群在罗氏培养基上生长的菌落形态

Fig.1Colonial morphology ofMycobacteriumtuberculosiscomplex grown in L-J medium

2.5结核分枝杆菌复合群菌种鉴定结果

对经MGIT TBc Identification Test初筛鉴定为结核分枝杆菌复合群的1份样品，进一步用基因分型结合药敏试验进行菌种鉴定。对一线抗结核药物链霉素、异烟肼、利福平和乙胺丁醇全部敏感，PNB、TCH阴性，对吡嗪酰胺耐药。根据以上结果，综合判定该结核分枝杆菌复合群为牛分枝杆菌。

2.6非结核分枝杆菌及其他抗酸阳性菌的菌种鉴定

15株抗酸阳性菌经MGIT TBc Identification Test初筛鉴定为非结核分枝杆菌或其他抗酸阳性菌，经基因测序分析，确认非结核分枝杆菌11株、棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)1株、马杜拉放线菌属(Actinomadura)3株。11株非结核分枝杆菌分别为禽分枝杆菌(M.avium)8株，土地分枝杆菌(M.terrace)1株，通俗分枝杆菌(M.triviale)1株，不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)1株。菌种鉴定结果及样品来源见表3。

表3菌种鉴定结果

Tab.3Identification results ofMycobacteriumstrains

DairyfarmCattleNo.TissueStrainidentification/SequencingresultSICTSICCTIFN-γA1PulmonarylymphnodeM.bovis+//2MilkM.triviale+//3MilkM.terrace+//4MilkM.avium+//B5LungM.avium+//6PulmonarylymphnodeM.avium+//7PulmonarylymphnodeActinomadura+//C8LungM.avium+//PulmonarylymphnodeM.avium+//9PulmonarylymphnodeM.avium+//D10SpleenM.nonchromogenicum+--11PulmonarylymphnodeM.avium++-12MesentericlymphnodeCorynebacteriumsp.++-AxillarylymphnodeActinomadura13PulmonarylymphnodeActinomadura++-14MesentericlymphnodeM.avium+-+

3　讨论

参与试验的奶牛场多年来坚持每年开展2次SICT全群监测，对检出的阳性牛进行扑杀和无害化处理，故结核病流行率处于较低水平。在5个奶牛场的54头SICT阳性牛中，有4个奶牛场的14头SICT阳性牛样品中分离到抗酸阳性菌，占SICT阳性牛的25.9%(14/54)；其中10头阳性牛样品中分离到分枝杆菌，占SICT阳性牛的18.5%(10/54)；仅1头阳性牛样品中分离到牛分枝杆菌，占1.9%(1/54)，表明SICT阳性牛的牛分枝杆菌分离率较低。SICT是目前我国牛结核病检测的常用方法，但一直受到检测特异性问题的困扰。有研究采用SICT在1 867头奶牛中检出阳性牛22头，对采集的阳性牛病料进行病原学检测，未发现牛分枝杆菌[6]。结核病的细菌学检查是发现病原的主要手段和途径，但由于分枝杆菌生长缓慢，一般需4～8周，且操作繁琐、检出率低，在生产实际中不宜推广应用。本研究认为，可将分枝杆菌快速分离培养及菌种鉴定检测技术引入SICT阳性牛的实验室诊断，进一步提高牛结核病检测的特异性。

对D奶牛场抽取的10头SICT阳性牛开展SICCT和IFN-γ试验复核检测，结果显示5头阳性牛样品中分离到抗酸阳性菌，但SICT、SICCT与IFN-γ试验结果不一致(表3)。通过本课题组前期对SICCT与IFN-γ试验的比较，证实在结核病低流行地区SICCT与IFN-γ试验符合率较低[3]。D奶牛场的检测结果进一步证实了该结论。理论上，SICCT和IFN-γ试验可排除禽型PPD反应阳性牛，而通常认为禽型PPD阳性是禽分枝杆菌等引发的非特异反应。D奶牛场的5头SICT阳性牛经病原学检测，均未分离到牛分枝杆菌，但2份样品中分离到禽分枝杆菌。该结果提示，在结核病低流行地区或奶牛场，为确保检测结果的准确性，有必要采用一种以上检测方法来验证。现在应用比较成熟的牛结核病检测方法有IFN-γ试验、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)等，可作为皮内变态反应试验的补充，而这些试验的主旨并非是诊断阳性牛个体，而是发现阳性牛群体，并采取相应的处置方法。阳性牛个体确诊应平行使用免疫学试验、病原学检测等方法。一些成功消灭牛结核病的国家的经验提示，当牛群结核病始终处于低流行时，在持续使用皮内变态反应试验开展监测的同时，应重视对皮试阳性牛病原菌进行分离及对分离菌株从基因水平上进行分离和鉴定。

从54头SICT阳性牛的解剖情况看，均未见结核病的典型病变。从不同组织的分枝杆菌分离率来看，牛奶和肺淋巴结的分离率分别是25.0%和11.4%，高于肠系膜淋巴结和肺组织。有研究发现，肺结核患者中约15%是饮用了结核病牛的奶而发病[7]。从本研究分离结果看，牛奶中虽未分离到牛分枝杆菌，但其分枝杆菌分离率最高，在12份现场采集的牛奶样品中共分离到禽分枝杆菌、土地分枝杆菌和通俗分枝杆菌。由此可见，未经消毒的牛奶被分枝杆菌污染的可能性较高，其食品安全和公共卫生安全应受到进一步关注。本研究从肺淋巴结分离到1株牛分枝杆菌。何昭阳等研究认为，肠淋巴结的分枝杆菌分离率高于额下淋巴结，其次是肺门淋巴结，但其分离到的5株牛分枝杆菌有4株来自肺淋巴结、1株来自肠淋巴结[8]。本研究认为，因牛结核分枝杆菌主要经呼吸道感染，侵入机体后，被巨噬细胞吞噬或将其带入局部淋巴结形成原发性病灶[9]，故在采集组织样品时应重点关注肺淋巴结。

118份组织样品中，16份分离到抗酸阳性菌，分离率为13.6%(16/118)；16份抗酸阳性菌样品中，12份为分枝杆菌，分离率为10.2%(12/118)。在12株分枝杆菌中，牛分枝杆菌1株，占8.3%(1/12)；非结核分枝杆菌11株，占91.7%(11/12)。在11株非结核分枝杆菌中，8株为禽分枝杆菌，占72.7%(8/11)。从分枝杆菌分离和鉴定结果看，SICT无法区分牛分枝杆菌感染与非结核分枝杆菌感染。有研究者将牛源非结核分枝杆菌回归动物实验，用非结核分枝杆菌注射牛犊，再用牛型PPD进行变态反应试验，发现非结核分枝杆菌均表现出相互交叉的变态反应阳性结果[10]。在自然环境和健康牛体内中，非结核分枝杆菌的存在比较普遍。林世平等对牛鼻腔分泌物中的非结核分枝杆菌进行分离，分离率高达50.5%[11]。毛冉等在健康牛的颌下淋巴结和肠系膜淋巴结中分离出非结核分枝杆菌[12]。一些研究者在SICT阳性牛的病原菌分离中发现，非结核分枝杆菌占分离株的81.5%[8]。据报道，从无病变的变态反应阳性牛体内分离比较多的非结核分枝杆菌主要有瘰疠分枝杆菌、鸟-胞内分枝杆菌复合群、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、浅黄分枝杆菌等[13]。因非结核分枝杆菌在自然环境中分布广泛，给结核病的准确诊断和治疗带来了困难。近年来，世界各国医疗卫生和动物临床均有非结核分枝杆菌发病的报道，已成为医学工作者的重要研究方向[14-17]。

除非结核分枝杆菌外，本研究还分离到1株棒状杆菌与3株马杜拉放线菌，抗酸染色均为阳性，但经后续的免疫色谱法初筛和菌种鉴定，最终排除分枝杆菌感染。因棒状杆菌和放线菌的胞壁多糖主要是阿拉伯糖和半乳糖，与分枝杆菌相似，故产生交叉反应，从而影响SICT结果判定。这进一步提示，在采用皮内变态反应试验开展奶牛结核病监测和净化工作时，应警惕由非结核分枝杆菌和其他抗酸阳性菌引起的非特异性干扰。

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.LIU Peihong,E-mail:shdwfy@163.com

Isolation and identification ofMycobacteriumfrom cows with delayed type hypersensitivity response to bovine purified protein derivative

WANG Quzhi1,JIANG Yuan2,SHEN Sufang1,SHEN Xin2,ZHAO Hongjin1,TANG Wenhong1,XU Feng1,YANG Xianchao1,LIU Peihong1

1.Shanghai Animal Disease Control Center,Shanghai 201103,China; 2.Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention,Shanghai 200336,China

To evaluate the specificity of single intradermal cervical tuberculin (SICT) of bovine purified protein derivative (PPD) in bovine tuberculosis detection,a total of 118 tissue specimens from 54 cows with positive reaction were collected and subjected to the detection ofMycobacterium.Acid-fast bacteria strains were isolated from 14 cows andMycobacteriumstrains were isolated from 10 cows.Mycobacteriumbovis(M.bovis) was isolated from one cow.Sixteen acid-fast bacteria strains were isolated from 118 tissue samples and 12 strains were identified asMycobacterium.The isolation rate ofMycobacteriumwas 10.2% (12/118).One strain was identified asM.bovisand the others were nontuberculousMycobacteria(NTM),such asM.aviumandM.terrace.M.bovisaccounted for 8.3% (1/12) and NTM accounted for 91.7% (11/12) of allMycobacteriarespectively.The results of pathogen detection indicated a low isolation rate ofM.bovisby SICT method.To ensure the accuracy of SICT,it is necessary to use more than one method to verify the results.The culture and species identification by using rapid detection techniques are recommended to be introduced into the program for tuberculosis elimination,which could improve the specificity of tuberculosis detection.

Delayed type hypersensitivity skin test; Cow with positive reaction;Mycobacterium

上海市科技兴农推广项目〔沪农科推字(2010)第1-2号〕，上海市市级农口系统青年人才成长计划〔沪农青字(2014)第2-13号〕

刘佩红

2016-04-09)