慢性呼吸道疾病患者呼吸道微生物群研究进展

侯东妮，童琳，宋元林

复旦大学附属中山医院呼吸科，上海 200032



·特约专稿·

慢性呼吸道疾病患者呼吸道微生物群研究进展

侯东妮，童琳，宋元林

复旦大学附属中山医院呼吸科，上海 200032

过去认为健康人肺部是无菌的，对疾病状态下呼吸道菌群的研究依赖传统培养技术。近年来,DNA测序技术应用于呼吸道标本的微生物检测，发现健康肺部存在复杂的微生物群。越来越多的证据表明，呼吸道微生物群在多种慢性呼吸道疾病发生和发展过程中扮演重要角色，与哮喘、慢性阻塞性肺病等疾病的临床表现、急性加重及预后相关。通过比较急性加重期与稳定期患者的呼吸道标本微生物群，形成了新的疾病假说，阐释了慢性呼吸道疾病急性加重的微生物学基础。未来对微生物测序数据的深度挖掘及基于临床问题的研究，有望为慢性呼吸道疾病的治疗提供新的靶点。

微生物组；哮喘；慢性阻塞性肺病；16S rRNA

近年来，随着分子生物学技术的应用，微生物菌群与肺部疾病关系的研究有了飞速进展。以往认为，健康状态下的下呼吸道是无菌的[1]；但DNA相关测序技术能检测出呼吸道标本中以往传统细菌培养不能发现的菌株，证实了呼吸道(包括上呼吸道和下呼吸道)中局部菌群的存在。

呼吸道微生物群是指上呼吸道和下呼吸道中存在的细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体等全部微生物的集合。呼吸道微生物群与其所在部位的宿主细胞及环境中影响两者相互作用的多种生物和非生物因素共同构成了呼吸道微生物组。不同于临床上普遍采用的针对某一种或几种细菌的呼吸道标本培养技术，基于核酸检测的微生物菌群分析包括呼吸道中所有细菌的种类及其比例，为了解菌群特征提供了更为全面的信息。基于技术的突破，越来越多的研究阐释了复杂的呼吸道微生物组及其在多种临床疾病过程中的作用，为呼吸道疾病的致病机制研究和治疗方法的探索开辟了新的领域[2-5]。

1　呼吸道微生物群研究新方法

早期的呼吸道微生物研究采用多种分子技术识别呼吸道标本中不同微生物的特征，往往需严格的为特定病原体制定的培养条件。新一代测序技术的发展使对整个微生物群的基因测序和分析成为可能，从而奠定了微生物组学研究的基础[6]。目前用于实现微生物组描述的方法主要有2种——rRNA小亚基[7]和宏基因组[8]。前者作为稳定的种系发生学标志，具有微生物鉴定和检测所需的保守性和特异性，包括用于古生菌和细菌的16S rRNA测序，以及用于真核细胞测序的18S rRNA测序。后者则是通过鸟枪法对所有微生物的全部DNA测序。16S rRNA测序针对基因组中的一个基因，花费相对较少，应用最广泛，但在研究微生物群的代谢及功能时需依赖宏基因组测序。对呼吸道样本的单次16S rRNA测序即可获得成千上万短基因组序列，通过与已建立的分类学数据库比对[9]，可描述多样性和种群组成等微生物群特征。结合定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，16S rRNA测序还可用于估计呼吸道样本的微生物负荷，其结果与传统定量培养相一致[10]。基于测序技术的微生物识别，其优点是不依赖严格的特殊培养条件，能提供传统培养不能发现的微生物信息[11]。

目前微生物组学研究采用的最常见的呼吸道标本为肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)及防污染标本毛刷(protected specimen brushing，PSB)。与肠道微生物组研究采用的微生物含量极高、不易被污染的粪便标本不同，理论上呼吸道样本在采集过程中易受到口咽部、鼻腔和上呼吸道微生物的污染，但众多研究表明上呼吸道污染对气管镜获得的呼吸道标本微生物群的影响甚小，经不同解剖学途径(经鼻或经口)采集的BALF标本中微生物群并无差别[12-15]。许多慢性阻塞性肺病(chronic obstructive lung disease，COPD)、囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)患者的呼吸道微生物组研究采用痰标本，虽然痰标本有更多被上呼吸道微生物污染的可能，但其微生物组特征仍与多种临床指标相关，表明口腔微生物的污染并不会消除痰液微生物组在不同临床条件下有意义的变化[16-19]。

2　正常人呼吸道的微生物生态学及其分布

呼吸道及肺泡持续暴露于外界环境中[20]，从口腔到肺泡在不同部位形成梯度变化的生态环境，成为一个特殊的生态系统。基于MacArthur和Wilson 于1963年提出的岛屿生态地理学平衡模型[21]，Dickson等于2014年提出了肺生态地理学修正岛屿模型[22]，通过微生物迁移、微生物消除和相对增殖速率3个因素预测微生物群的载荷和相对构成。健康人肺生态环境不适于微生物生长，故其微生物群主要由上呼吸道细菌迁移及消除速率决定；但在疾病条件下，以上3个因素的变化将导致肺微生物群的变化。

肺部微生物迁入主要通过空气吸入、微量误吸[23-24]及上呼吸道微生物经黏膜表面直接播散3种方式实现。研究表明，空气中的微生物与健康人肺部中的不同[25-26]，后者的组成更接近口腔中的[27-28]，证明微生物迁移中微量误吸比空气吸入占更重要的地位。微生物的清除主要通过黏膜纤毛运动、咳嗽及天然免疫和适应性免疫。呼吸道及肺泡局部的微生物生长条件有很大差异，包括氧分压、pH值、相对血液灌注、相对肺泡通气、温度、上皮结构、吸入颗粒沉降及免疫细胞数量和功能等，这些因素决定了微生物生长和繁殖速率[22]。远端肺泡表面覆有肺泡表面活性剂，后者对某些细菌菌株具有抑制作用，从而对微生物群有选择性。

3　慢性呼吸道疾病的微生物组学研究

3.1哮喘

随着呼吸道微生物组概念的提出，越来越多的研究致力于阐释多种慢性呼吸道疾病发生和发展过程中微生物组的作用。对婴幼儿呼吸道标本的研究发现，生命早期某些呼吸道致病菌的定植与哮喘的发生密切相关。呼吸道标本培养发现，培养出卡他莫拉菌、流感嗜血杆菌或肺炎链球菌等细菌的儿童发生哮喘的比例明显增加[29-30]，且这些微生物与哮喘的严重程度和急性加重有关[31]。基于16S RNA测序技术的多项研究发现，哮喘患者呼吸道标本中变形杆菌门，包括流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等多种呼吸道致病菌的比例高于正常人群[32-33]。这些致病菌的增加同样见于无规律吸入激素治疗的患者[33]，表明呼吸道菌群的这一特征是哮喘本身的特征，而不仅仅是吸入激素带来的免疫抑制的结果。此外，呼吸道菌群的多样性和组成与气道高反应性程度相关，且根据患者基线状态的呼吸道菌群可预测其对克拉霉素和吸入激素治疗的反应[32,34]。体外研究将BALF中的巨噬细胞和副流感嗜血杆菌培养，也支持病原菌在降低激素治疗反应中的作用。这些研究证明，儿童期呼吸道微生物组的改变是哮喘发生的机制之一，同时揭示了呼吸道菌群与哮喘的病理生理、临床表型及严重程度之间的关联。

3.2COPD

微生物感染在COPD发生和发展中的作用是呼吸道微生物组研究的热点[35]。慢性支气管炎导致的气道高反应状态及肺气肿患者肺泡损毁导致的肺内部表面积极度减少使肺部微生物生态环境发生改变，进而导致微生物群的改变。但研究表明，不同于哮喘患者在疾病早期即表现出微生物群的改变，轻中度COPD患者呼吸道微生物群与正常人差别并不明显，仅在重度COPD患者(FEV1小于预计值的40%～50%)中存在菌群变化[16,36-38]。COPD患者呼吸道的微生物谱发生改变，其细菌多样性与疾病严重程度呈负相关[39]。重度COPD患者呼吸道中，微生物组成由吸烟和非吸烟健康人群的拟杆菌门为主变为以变形菌门为主[39-40]。另有研究观察到呼吸道中真菌的存在与COPD相关，如COPD患者呼吸道中耶式肺孢子菌的定植与呼吸道阻塞的严重程度呈正相关[41]。COPD患者痰标本中曲霉常见，其对曲霉的敏感程度也与肺功能损伤程度密切相关[42]。

尽管轻中度COPD患者呼吸道菌群与健康人群基本一致，但也有证据表明这些早期COPD患者微生物组处于功能异常状态，存在某些重要小成员的出现或缺失，导致宿主对病毒感染等炎症状态的反应更易失控。虽然基线时痰标本微生物组组成和载荷与正常人相似，但暴露于病毒后轻中度COPD患者标本中的变形菌门细菌(尤其是致病的嗜血杆菌属)明显增多[16]。这些急性加重期的主要菌种在病毒感染前及急性加重缓解后均持续存在，证明COPD患者在病毒感染后发生的急性加重源于稳定期即存在的异常。

3.3支气管扩张

对支气管扩张相关微生物组学的研究主要集中在CF患者。不论是在临床稳定期还是急性加重期，几乎所有CF患者痰液中均能培养出呼吸道致病菌，以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌为主。利用新型微生物组学技术比较不同年龄CF患者的痰液菌群，发现年龄与呼吸道微生物组的丰度和多样性呈负相关，这一改变部分归因于老年患者的肺功能损伤及抗生素的长期使用[18,43-44]。

4　慢性呼吸道疾病急性加重期患者呼吸道的菌群特点

虽然对CF及COPD急性加重期的治疗以抗感染为主，但对细菌感染与疾病急性加重之间的关系一直存在争议。越来越多的证据表明，慢性肺部疾病急性加重有别于急性肺部感染。急性细菌感染对抗生素治疗的反应迅速且持久，但急性加重期患者的抗生素治疗效果不如急性细菌感染。此外，急性细菌感染可引起严重的脓毒血症甚至休克，而急性加重期患者极少发生脓毒血症，且痰标本中的细菌载荷在急性加重期并无增加[45]。对急性加重期患者微生物组的分析也未发现细菌密度和菌群多样性的变化[46-47]。

基于以上研究，有学者提出以呼吸道微生态失调模型来阐释宿主与微生物群之间的相互作用，认为微生物群改变与宿主炎症反应之间形成一个环路，即表现为慢性肺部疾病的急性加重[48]。任一炎症触发因子，如病毒感染、过敏原暴露等可引发宿主一系列炎症反应，后者改变了呼吸道微生物群的生长条件。黏液分泌增加和呼吸道渗透性增加为细菌提供了健康肺部含量极少的营养物质；且分泌的黏液在肺局部形成微囊，其内部氧分压、pH值、温度等有利于致病菌的选择性生长。此外，炎症细胞聚集所释放的儿茶酚胺和细胞因子通过信号转导途径直接促进某些细菌的生长，同时炎症细胞对细菌的杀伤作用对某些细菌种类也产生选择性压力，使呼吸道菌群向某些细菌偏移。以上这些细菌生长条件的改变共同导致内稳态的动态平衡被打破，产生呼吸道微生态失调。新的占主导地位的菌株及其改变的毒力因子和增强的免疫原性继而引发更强烈的呼吸道免疫反应，后者进一步加重局部细菌生长条件的变化，从而形成一个炎症-生态失调的正反馈环。新强势菌株的增殖及失调的炎症反应造成肺组织持续损伤，在经历炎症-生态失调的加重过程后，新的内稳态才重新建立。在这个模型中，COPD急性加重过程的起始是炎症触发导致的微生态失调，而两者之间的双向促进使这一过程在初始触发因素消除后仍持续一段时间。

以上模型所提及的炎症-生态失调的正反馈仅见于患有慢性呼吸道炎症的患者，而正常人中炎症触发因素所引发的气道反应是可控的，与触发因素的强度和呼吸道微生物载荷成比例，并随着刺激因素的去除而恢复。如前所述，即便是在稳定期，COPD患者呼吸道中炎症细胞的聚集和激活长期存在[49-50]，同时伴随呼吸道微生物群的变化[5]，两者均处于异常状态，使得稳定期宿主与微生物之间的稳态相对脆弱，一旦在触发因素作用下稳态失衡，即形成上述正反馈环而表现为不成比例、严重持续的呼吸道炎症。

5　呼吸道疾病的微生物治疗

基于以上对正常人群和不同呼吸道疾病患者呼吸道微生物组的研究，为慢性呼吸道疾病的治疗性干预提供了新的可能。许多临床研究致力于通过调节肠道微生物群治疗炎症性肠病，同样对呼吸道微生物群的干预也有望成为慢性呼吸道疾病治疗的选择之一[5]。目前，对微生物群的干预可通过摄入单个菌株制剂(益生菌、合生元等)或肠道微生物移植实现。研究证实，经口给予某些特定益生菌如加氏乳杆菌等能降低哮喘患儿症状的严重程度，并改善其肺功能[51]。直接呼吸道给予益生菌制剂也可作为口服应用以外的另一选择[52]。这些益生菌的治疗作用有赖于特定菌株、时间和剂量，需更多的临床研究。

6　结语

迄今为止，有关呼吸道微生物群的分析主要在学术研究领域，与临床应用仍有一定距离。越来越多的呼吸道微生物研究致力于将临床应用相关问题与微生物群数据联系，但对呼吸道微生物群组成的了解仅是理解其在健康和不同疾病状态下与宿主之间相互作用的第一步。众多的新技术，如转录组学、蛋白质组学、代谢组学等的发展，使得研究细菌的功能状态成为可能，从而更深层地研究微生物组的特征和变化。

目前，对呼吸道微生物群的研究仍存在诸多挑战，如不同肺部位的微生物群显然在微生物的数量和组成上存在区别，如何对不同部位取样并避免上呼吸道微生物的污染是研究中值得注意的问题。经气管镜采样所获研究结果较痰标本为优，但气管镜作为有创操作，对病情危重患者及中重度急性加重患者标本采集困难，且难以在不同病程过程中反复采集系列样本。另一方面，新一代测序技术能发现标本中含量极少的微生物种类，促进了微生物组学的飞速发展，但应用分子技术研究微生物群不能避免死亡微生物的干扰，使得接受抗感染治疗的标本不能准确反映细菌数量。

综上所述，呼吸道微生物群的变化在多种慢性呼吸道疾病的发生和发展中起重要作用。这些微生物群的特征有利于对疾病进展的追踪和治疗效果的评价，尤其对评价抗生素治疗有重要意义。抗生素治疗对细菌耐药性的产生有促进作用，还可导致整个微生物群组成的改变，使得具有天然耐药性的菌属选择性生长。因此，抗生素对微生物群的影响是临床治疗疾病急性加重时需考虑的重要方面。随着未来微生物组学研究技术的不断改进，基于临床问题和临床标本的研究将使呼吸道微生物组学相关领域不断向临床应用转化，有望为慢性呼吸道炎症疾病的诊治提供新的思路。

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.SONG Yuanlin,E-mail: song.yuanlin@zs-hospital.sh.cn

Role of lung microbiome in chronic respiratory diseases

HOU Dongni,TONG Lin,SONG Yuanlin

Department of Pulmonary Medicine,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China

The lungs of healthy individuals are previously considered to be sterile.However,modern microbiological techniques using DNA sequencing reveal the existence of a complex and dynamic microbiome in the normal respiratory tract.There is growing evidence that the respiratory microbiome has an important effect on the development and progression of chronic respiratory diseases and the features of respiratory microbe are associated with clinical phenotypes and prognosis.Comparison of respiratory samples of patients between stable and exacerbation phases leads to new hypothesis for exacerbation of these diseases.Future studies of lung microbe,with progresses in sequencing data analysis and study design focused on clinical problems,will provide a potential therapeutic target for chronic respiratory diseases.

Microbiome; Asthma; Chronic obstructive lung disease; 16S rRNA

宋元林

2016-07-01)