五味子乙素对BaP致HTR-8/SVneo侵袭力损伤的保护

王梦，梁婧，侯海燕，董渠龙，陈亚琼

·论著·

五味子乙素对BaP致HTR-8/SVneo侵袭力损伤的保护

王梦，梁婧，侯海燕，董渠龙，陈亚琼

目的：以人绒毛膜外滋养层细胞（human trophoblastHTR-8/SVneo，简称HTR）细胞株为研究载体，研究五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）对苯并芘（benzo［a］pyrene，BaP）致HTR细胞侵袭力损伤的影响。方法：实验分为对照组、BaP染毒组、不同浓度Sch B（0.5，1，2μmol/L）干预染毒组，通过新型四唑化合物（MTS）法检测细胞增殖情况，明确BaP染毒及Sch B干预剂量；通过Transwell侵袭实验检测BaP染毒后以及Sch B干预后细胞侵袭力的改变。结果：①MTS检测细胞增殖情况：与对照组相比，20μmol/L浓度BaP作用后细胞增殖明显下降（P＜0.01），不同浓度Sch B（0.5，1，2μmol/L）干预后细胞增殖情况优于BaP染毒组（P＜0.05）。②Transwell细胞侵袭实验：与对照组相比，BaP染毒组细胞侵袭力明显下降（P＜0.01），不同浓度Sch B干预组细胞侵袭力也呈下降趋势（P＜0.05）；与BaP染毒组相比，Sch B干预组细胞侵袭力明显提升（P＜0.05）。结论：一定浓度的BaP会对HTR的细胞增殖及侵袭力造成损伤，Sch B可以预防BaP对HTR细胞增殖造成的损伤，同时提高细胞侵袭力。

五味子属；苯并芘；细胞增殖；滋养层细胞

苯并芘（benzo［a］pyrene，BaP）作为多环芳烃类化合物（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）中的典型代表，普遍存在于日常生活中［1-2］，其生殖毒性已被证实，目前关注的热点是其对早期胚胎发育的影响。早期胚胎植入过程中的关键步骤是滋养层细胞对子宫内膜的侵入，故本研究从BaP对滋养层细胞侵袭力造成损伤的角度出发，探讨传统中药是否可以预防BaP对滋养层细胞侵袭力造成的损伤。既往研究显示五味子在保胎护胎的方剂中起着重要作用，五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）作为五味子中的重要活性成分，普遍应用于现代临床研究中。本研究选取人绒毛膜外滋养层细胞（human trophoblastHTR-8/SVneo，简称HTR）为实验载体，在BaP损伤滋养层细胞侵袭力的同时，明确Sch B是否可以改善和预防BaP对细胞侵袭力造成的损伤。

1 材料与方法

1.1 实验药品HTR细胞株由加拿大Graham Professor惠赠。Sch B（中国药品生物制品检定所），分子质量400.46 ku，微溶于水，纯度≥99%，体外实验用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide DMSO）配制。BaP（美国Sigma公司），分子质量252.31 ku，不溶于水，纯度≥99%，体外实验用DMSO配制。

1.2 实验试剂RPMI1640培养基、胎牛血清、0.125%胰蛋白酶、DMSO溶剂（美国Gibco公司），0.1mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，天津市广成化学试剂有限公司），MTS试剂盒（Promega北京生物技术有限公司）、Transwell小室（Chemicon公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养将对数生长期的HTR8-SVneo细胞接种于96孔板中，每孔200μL（密度5.0×103个/mL）含10%胎牛血清、100U/mL青霉素的RPMI1640的培养液，在37℃、含5%CO2的培养箱中培养24 h。

1.3.2 新型四唑化合物（MTS）法检测细胞增殖情况①取对数生长期的细胞104个/mL接种于96孔板内培养，分别检测BaP染毒浓度（2，5，10，20，50μmol/L），以及Sch B（0.5，1，2，5，10 μmol/L）干预浓度，之后选取合适浓度检测细胞增殖情况。②最终实验分5组，对照组：不给予任何处理；BaP染毒组：20 μmol/L BaP（24 h）；Sch B低剂量组：0.5μmol/LSch B（48 h）+ 20μmol/LBaP（24 h）；Sch B中剂量组：1μmol/LSch B（48 h）+ 20μmol/LBaP（24 h）；Sch B高剂量组：2μmol/LSch B（48 h）+ 20μmol/LBaP（24 h）。③将MTS与培养基按照1∶5的比例配置好，吸弃96孔板培养基，每孔加入20μLMTS试剂及100μL完全培养基，并设有调零组，置于37℃、5%CO2温箱中培养150min。④用酶标仪检测波长490 nm条件下的光密度值（OD），实验重复3次。按公式：细胞存活率（%）=（实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%，计算细胞活力。

1.3.3 HTR细胞侵袭力的检测应用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭力，实验选取直径为65mm，孔径大小为8μm的Transwell小室，每组实验重复3次。实验分6组，对照组：不给予任何处理；DMSO溶剂组：200μL 0.1%DMSO培养液；BaP染毒组：20μmol/L BaP；Sch B低剂量组：0.5μmol/L Sch B+20μmol/LBaP；Sch B中剂量组：1μmol/LSch B+20μmol/L BaP；Sch B高剂量组：2μmol/LSch B+20μmol/LBaP。①水化基底膜，将小室放入24孔板中，在上室加入300μL预温的无血清培养基，室温下静置30min，使基质胶再水化，之后再吸去培养基。②制备细胞悬液，先将对数生长的细胞无血清饥饿培养24 h，消化离心后，加入不同培养液配制细胞悬液，最终将细胞浓度消化调整为1.0×105个/mL。③接种细胞，在培养板中加500μL含10%胎牛血清（fetalbovine serum，FBS）的完全培养基，同时各组取200μL细胞悬液种植于小室内在37℃、含5%CO2培养箱中培养6 h，之后取出培养板，弃去各组培养液。④固定染色，用棉签擦去未穿透基底膜的基质胶上和小室内的细胞，反复用PBS冲洗，再加入500μL着色剂至空闲的24孔板中，将小室放入有着色剂的孔中20 min。⑤计数细胞，将小室放入烧杯中用水清洗数次，后将小室风干。在显微镜下，每孔随机选取4个非重叠视野照相，人工计数后统计结果。

1.4 统计学方法采用SPSS 16.0统计软件进行分析。定量资料满足正态分布用均数±标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析，2组间的比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTS检测细胞增殖情况

2.1.1 BaP染毒浓度与对照组相比，HTR-8/SVneo在各浓度BaP作用24 h后细胞增殖明显下降，随着BaP浓度的不断增大，细胞增殖不断下降（P＜0.05），在20μmol/L浓度作用时细胞增殖降低最明显（P＜0.01），但随着BaP浓度的进一步增加，当浓度达到50μmol/L时，细胞增殖情况并未持续下降（P＜0.05），最终选取BaP染毒浓度为20μmol/L。见图1。

图1 不同浓度BaP处理HTR细胞后细胞存活率

2.1.2 Sch B干预浓度与对照组相比，HTR-8/ SVneo在Sch B各浓度作用6 h后，随着Sch B浓度不断增大，细胞增殖没有明显变化（P＞0.05），直到浓度达到10μmol/L时，细胞增殖有所下降（P＜0.05），见图2。

2.1.3 Sch B干预BaP染毒细胞与单纯BaP染毒模型比较，HTR-8/SVneo在不同浓度Sch B（0.5，1，2 μmol/L）干预后，细胞增殖能力明显增强（P＜0.05），随着浓度的增大，细胞增殖能力也增加。与对照组比较，不同浓度Sch B干预后细胞增殖有所下降（P＜0.05）。见图3。

图2 不同浓度Sch B处理HTR细胞后细胞存活率

图3 不同浓度Sch B+BaP处理HTR细胞后细胞存活率

2.2 HTR-8/SVneo细胞侵袭力的检测Transwell侵袭实验结果显示：与对照组相比，DMSO溶剂组侵袭力差异无统计学意义（P＞0.05）；BaP染毒组侵袭力明显下降（P＜0.01），不同浓度Sch B作用细胞后，细胞侵袭力也有所下降（P＜0.05）；与BaP染毒组比较，不同浓度Sch B干预组作用细胞后，细胞侵袭力明显增强（P＜0.05），随着浓度的增加，侵袭力也随之增强，见图4和图5。

3 讨论

在BaP生殖毒性的相关研究中，妊娠早期胚胎发育过程对环境有害物质BaP最为敏感［3］。在妊娠早期，最关键的环节就是胚胎着床，而确保胚胎是否能成功着床的关键因素是绒毛膜外滋养层细胞对子宫内膜的适度侵袭，滋养层细胞过度的侵入会导致多种妊娠滋养细胞疾病（如绒毛膜癌、葡萄胎）的发生，而侵入不足则会造成自然流产、胎儿生长受限、子痫前期等疾病［4-5］。因此研究BaP对早期胚胎着床过程中滋养细胞侵袭力的影响及其可能的保护因素具有重要的意义，既往的研究表明BaP与滋养层细胞侵袭力的降低有关［6］。

图4 Transwell实验检测HTR-8/SVneo细胞模型侵袭力（×100）

图5 不同浓度Sch B+BaP处理HTR细胞后细胞侵袭力

中医在女性生殖健康中有其独特的治疗优势，五味子是临床常用的滋补固涩类中药，归肺、心、肾经。而大多数医家认为滑胎也就是西医学称复发性流产，多是由肾虚导致的。中医学认为肾是生命之根，先天之本，肾主藏精，精能化气，肾精所化之气，即为肾气。肾精的盛衰，始终影响着整个孕期，而且也是能否受孕的关键。若肾气亏损，便不能固摄胎元而致流产。又因女子以肝为本，五味子能补肝肾之气，肝脉既能得肾气之温煦，肾精也能得肝血之滋养。因此推断五味子可通过补肾精来达到保胎固胎的效果。

而现代研究表明，五味子中的药用成分主要是木脂素［7］，Sch B又是五味子木脂素的主要活性成分之一［8］。同时有多项研究显示Sch B具有保肝、抗氧化、抗肿瘤的作用［9-11］，其可以影响肿瘤细胞的侵袭力［12］，肿瘤细胞的侵袭过程与胚胎早期人绒毛膜外滋养层细胞对子宫内膜的侵袭十分相似，因此推测Sch B可以预防BaP对细胞侵袭力的影响，从而达到对早期胚胎的保护作用。

为了明确BaP对滋养层细胞侵袭力的损伤，首先要选取BaP染毒浓度，明确其对细胞增殖的影响，也就是对细胞存活率的影响。本研究采用MTS实验方法检测BaP对细胞增殖的影响，发现HTR细胞在BaP作用24 h后，随着染毒浓度的增加，细胞存活率明显下降，说明两者存在剂量依赖性，吴念等［13］的研究与本研究结果一致，当浓度达到20μmol/L时，BaP对细胞增殖抑制最明显，但当浓度升至50 μmol/L时，BaP对细胞损伤并没有持续下降，考虑可能是因为BaP的溶解性引起浓度过大而产生沉淀，导致高浓度BaP并未直接作用于细胞，故其并未影响到细胞的增殖情况。

在明确BaP对HTR细胞存活率有损伤后，本研究应用MTS实验检测Sch B单独作用后细胞增殖情况，同时进一步为实验确定干预浓度。在检测Sch B药物本身对细胞增殖情况的影响时发现，一定浓度内的Sch B作用细胞后，细胞增殖情况未见明显改变，而当浓度达到10μmol/L时，细胞增殖出现下降，说明其降低了细胞存活率，因此提示高浓度的Sch B不仅不会对细胞产生增殖作用，反而对细胞增殖有抑制作用。

本研究选取低、中、高（0.5，1，2μmol/L）3个Sch B浓度作用于BaP染毒后HTR细胞模型，用MTS实验检测各浓度作用后细胞存活率，与对照组比较，单纯染毒组与药物干预组细胞增殖都有所减少，说明Sch B干预染毒细胞后，细胞存活率未恢复至染毒前水平，但是与BaP染毒细胞比较，Sch B不同浓度干预后，细胞增殖情况明显好转，说明Sch B虽未使细胞存活率恢复至染毒前水平，但较染毒细胞相比，明显提高了其细胞存活率，并随着Sch B浓度的增大，细胞增殖提高程度越明显，说明两者存在浓度依赖性关系。

本研究进行了Transwell侵袭实验，其常用于研究肿瘤细胞的侵袭能力。有研究发现单独使用Sch B后肿瘤细胞的侵袭力并未改变，但可以降低诱导因子处理后的肿瘤细胞侵袭［12］，这就说明Sch B对细胞的侵袭力是有影响的。本研究利用其研究BaP染毒HTR细胞的侵袭力，发现BaP染毒后HTR细胞穿透小室的细胞数明显减少，说明细胞侵袭力明显下降。Sch B低、中、高（0.5，1，2μmol/L）3个浓度干预细胞后，与对照组相比，干预组各浓度都未使细胞侵袭力恢复至染毒前水平，但在Sch B干预后染毒细胞穿透聚碳酸酯膜的数量与BaP染毒组相比明显增加，说明干预后细胞的侵袭力明显优于BaP染毒细胞，随着浓度的增大，其穿透基底膜的细胞数越多，说明Sch B对BaP染毒细胞侵袭力的保护作用与Sch B呈浓度依赖性。

目前关于BaP对细胞侵袭力损伤的研究并不多，更少有关其造成损伤的机制研究，本研究证实BaP会对滋养层细胞活力造成影响并降低其侵袭力，Sch B在不影响细胞存活率的同时还可以保护BaP对细胞侵袭力的损伤，这为发掘预防环境污染物对人类生殖力损伤的药物研究提供了新思路。

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The Protection Effect of Schisandrin B on Extravillous Trophoblast Cell Line Aggressive Damage Caused by BaP

WANG

Meng，LIANG Jing，HOUHai-yan，DONGQu-long，CHEN Ya-qiong.DepartmentofObstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of Medical College of Chinese People′s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China（WANGMeng，HOU Hai-yan，DONG Qulong，CHEN Ya-qiong）；Tianjin Key Laboratory for Prevention and Control of Occupational and Environmental Hazards，Tianjin 300162，China（HOU Hai-yan，CHEN Ya-qiong）；Guang′anmen Hospital China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China（LIANG Jing）

CHENYa-qiong，E-mail：chenyq82@gmail.com

Objective:Using human trophoblast HTR-8/SVneo（HTR）cell lines for the study of the carrier to study Schisandrin B（Sch B）′s action of benzo［a］pyrene（BaP）damage effecton HTR cell lines aggressivity.Methods：Experiment is divided into the controlgroup，the BaP infected group，different dose Sch B（0.5，1，2μmol/L），intervention infected groupcell proliferation by MTSexperimental detection，clear BaP canister and Sch B intervention dose，by Transwell invasion experiment after the detection of BaP infected cells and Sch B cell invasion force change after intervention.Results：①The MTS test cell proliferation，compared with control group，20μmol/L BaP concentration cell proliferation significantly decreased after effect（P＜0.01），after Sch B（0.5，1，2μmol/L）intervention the cellproliferation isobviously better than BaP infected group（P＜0.05）.②Transwellcell invasion experiment，compared with controlgroup，the BaPcells infected group wasmuch lessaggressive（P＜0.05）.Sch B intervention group cell invasion force also declined（P＜0.05）.Compared with the infected group，Sch B cells ofaggressive intervention group was obviously ascending（P＜0．05）.Conclusions：①A certain concentrations of BaP damaged HTR cell proliferation and invasion force.②Sch B can prevent the damage of BaP of HTR cell proliferation，and at the same time improve cellaggressivity.

Schisandra；Benzo（a）pyrene；Cellproliferation；Trophoblastcell（JInt Obstet Gynecol，2016，43：590-593）

2016-03-22）

［本文编辑秦娟］

国家自然科学基金（81273977）；武警后勤学院附属医院种子基金（FYM201415）；天津市应用基础与前沿技术研究计划（15JCQNJC12300）

300162天津，中国人民武装警察部队后勤学院附属医院妇产科（王梦，侯海燕，董渠龙，陈亚琼）；天津市职业与环境危害防制重点实验室（侯海燕，陈亚琼）；中国中医科学院广安门医院南区（梁婧）

陈亚琼，E-mail：chenyq82@hotmail.com