Foxp3对肺癌细胞增殖及成瘤的影响①

刘瑞敏　晁玮霞　王少龙　王明丽　贾彩云　白慧玲　马远方

(河南大学细胞与分子免疫学重点实验室抗体药物河南省工程实验室，开封475000)



Foxp3对肺癌细胞增殖及成瘤的影响①

刘瑞敏晁玮霞王少龙王明丽贾彩云白慧玲马远方

(河南大学细胞与分子免疫学重点实验室抗体药物河南省工程实验室，开封475000)

目的：研究转录因子Foxp3在肺癌细胞中的高表达对肺癌细胞增殖及成瘤的影响。方法：利用脂质体转染法建立稳定高表达Foxp3的NCIH-hFoxp3肺癌细胞株。MTT法观测NCIH-hFoxp3及对照细胞的增殖。ELISA法检测NCIH-hFoxp3及对照细胞IL-8、IL-10的分泌。建立移植瘤小鼠模型，观察成瘤情况。结果：成功建立高表达Foxp3的NCIH-hFoxp3肺癌细胞株；与阴性对照相比，NCIH-hFoxp3细胞增殖减慢，但成瘤能力强。NCIH-hFoxp3细胞培养上清IL-8表达量减低，IL-10表达量升高。 结论：高表达Foxp3的肺癌细胞可能通过表达细胞因子改变局部生长的微环境，逃逸免疫监视，而促进肿瘤细胞的成瘤和发展。

Foxp3；高表达；增殖；成瘤

调节性T细胞(Treg)在机体免疫监视过程中发挥重要作用，转录因子Foxp3是Treg 的标志性分子，在Treg细胞发育及功能维护方面起关键作用[1]。近些年的研究显示，胰腺癌、黑色素瘤、肺癌等多种肿瘤组织高表达Foxp3[2,3]，并具有类似Treg的免疫抑制作用，与病人预后差有关。而Foxp3在肿瘤细胞高表达对肿瘤细胞本身的影响报道较少，本实验要建立稳定高表达Foxp3的肺癌细胞株，探讨Foxp3的高表达对肺癌细胞增殖及成瘤能力的影响，为肿瘤治疗提供指导策略。

1　材料与方法

1.1材料肺癌细胞NCIH-1299来自于本实验室，pcDNA3-hFoxp3质粒和pcDNA3对照质粒由田文志教授馈赠。Lipofectamine 2000和cDNA第一链合成试剂盒购自Invitrogen，G418购自Sigma，鼠抗人Foxp3 单克隆抗体购自Abcam，人IL-8和IL-10 ELISA试剂盒购自博士德生物公司,裸鼠购自中医医学科学实验动物研究所。

1.2方法

1.2.1转染并筛选稳定高表达Foxp3的肺癌细胞NCIH-hFoxp3将质粒pcDNA3-hFoxp3和对照质粒pcDNA3转染到肺癌细胞NCIH-1299中，转染步骤按照Invitrogen公司Lipofectamine 2000试剂盒的说明书。用G418加压筛选转染的细胞，浓度从300 mg/L加至1 000 mg/L，采用有限稀释法亚克隆挑选稳定高表达Foxp3细胞株，命名为NCIH-hFoxp3。

1.2.2 RT-PCR及Western blot检测转染效果取NCIH-hFoxp3及对照细胞，用Trizol法提取RNA，按照逆转录试剂盒操作说明将获得的RNA转录成cDNA。扩增Foxp3目的片段，上游引物5′-AGCTGCCCACACTGCCCCTA-3′ ；下游引物5′-CCGCCTGGCAGTGCTTGAGG-3′，产物为453 bp。β-actin为内参：上游引物5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′；下游引物5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，产物为220 bp。

取NCIH-hFoxp3及对照细胞提取蛋白，做SDS-PAGE电泳，电泳结束后将样品转移至PVDF膜上，加鼠抗人Foxp3抗体过夜，PBST洗涤后加山羊抗鼠二抗，暗室显影，用β-actin为内参。

1.2.3ELISA法检测NCIH-hFoxp3和对照细胞培养上清IL-8、IL-10表达差异以相同的数目把两种细胞接种到六孔细胞培养板中，设3个复孔。分别在培养24、36、48 h时收集细胞培养上清，离心5 min。按照ELISA 试剂盒的说明书操作步骤检测两组细胞IL-8和 IL-10表达量的差异。

1.2.4MTT法检测NCIH-hFoxp3和NCIH-control两组细胞增殖以相同细胞数目把两种细胞加入96孔培养板中，准备7块板，每组设6个复孔。用MTT法在此后1～7 d时检测490nm处各孔的OD值。

1.2.5移植瘤裸鼠模型的建立NCIH-hFoxp3和NCIH-control细胞分别消化计数，每只裸鼠接种5×106个细胞。接种后每隔2 d进行裸鼠称重统计记录，观察每只裸鼠出瘤时间，记录瘤体生长情况。4～6周后解剖取瘤，记录瘤重以及瘤体积，切取边缘组织福尔马林固定，剩余的组织冻存留用；眼底静脉取血，离心取上清，-80℃保存。

1.2.6Western blot检测裸鼠肿瘤组织中Foxp3的表达对照组裸鼠肿瘤组织提取蛋白，做SDS-PAGE电泳，电泳结束后将样品转移至PVDF膜上，加鼠抗人Foxp3抗体过夜，加山羊抗鼠二抗，暗室显影，用β-actin作为内参。

1.2.7定量PCR检测NCIH-hFoxp3和NCIH-control裸鼠肿瘤组织中IL-8和IL-10的表达Trizol法提取RNA，按照逆转录试剂盒操作说明将RNA转录成cDNA。扩增IL-8和IL-10目的片段，IL-8上游引物5′-GGTGCAGTTTTGCCAAGGAG-3′ ；下游引物5′-TTCCTTGGGGTCCAGACAGA-3′，产物为183 bp。IL-10上游引物5′-ACATCAAGGCGCATGTG-AAC-3′ ；下游引物5′-GCCACCCTGATGTCTCAGTT-3′，产物为241 bp。β-actin为内参：上游引物5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′；下游引物5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，产物为220 bp。用荧光定量 PCR 仪所配软件Rotor-Gene 6000 Series Software 对实验结果进行分析。

2　结果

2.1建立稳定高表达Foxp3的细胞株NCIH-hFoxp3RT-PCR结果如图1所示：选4个NCIH-hFoxp3细胞克隆进行Foxp3基因扩增，PCR产物453 bp，亮度明显高于NCIH-1299和空白质粒对照细胞，表明Foxp3在mRNA水平高表达。Western blot结果如图2： NCIH-hFoxp3细胞在48 kD大小的位置出现明显的条带，而NCIH-1299细胞和空白质粒对照细胞在48 kD大小的位置没有出现明显的条带，表明pcDNA3-hFoxp3质粒成功转染到NCIH-1299细胞中，并在蛋白水平上高表达。

2.2NCIH-hFoxp3和对照细胞培养上清IL-8、IL-10的表达结果如图3和图4所示。两组细胞上清中IL-8的含量都随培养时间的增加而增加； NCIH-hFoxp3细胞组中IL-8的含量明显低于对照组，两组的差异有统计学意义。NCIH-hFoxp3细胞组上清中IL-10的含量随时间的增加有明显升高，在36 h后含量高于对照组，36 h后两组的差异有统计学意义。

图1　高表达Foxp3的细胞株NCIH-hFoxp3的PCR鉴定Fig.1　Identification of NCIH-hFoxp3 by PCR

图2　高表达Foxp3的细胞株NCIH-hFoxp3的Western blot鉴定Fig.2　Identification of NCIH-hFoxp3 by Western blot

图3　两组细胞培养上清不同时间IL-8含量对比Fig.3　Concentration of IL-8 in tumor supernatants at different timeNote: *.P<0.01 vs the control.

图4　两组细胞培养上清不同时间IL-10含量对比Fig.4　Concentration of IL-10 in tumor supernatants at different timeNote: *.P<0.05,**.P<0.01 vs the control.

图5　NCIH-hFoxp3和对照组细胞的增殖Fig.5　Proliferating capacity of NCIH-hFoxp3 and NCIH-control

图6　两组成瘤模型裸鼠肿瘤直径的比较Fig.6　Comparison of tumor nodules between NCIH-hFoxp3 and NCIH-control

图7　两组裸鼠肿瘤组织中Foxp3表达的差异Fig.7　Expression of Foxp3 in NCIH-hFoxp3 and NCIH-control tumor nodules

图8　NCIH-hFoxp3和NCIH-control裸鼠肿瘤组织中IL-8和IL-10的表达 Fig.8　Comparison of IL-8 and IL-10 relative expression levels between NCIH-hFoxp3 and NCIH-control tumor nodules

2.3 Foxp3的高表达抑制了肿瘤细胞的增殖结果如图5所示： NCIH-hFoxp3细胞的增殖比NCIH-control组减慢，差异有统计学意义。

2.4移植瘤裸鼠成瘤的动态变化NCIH-hFoxp3组小鼠在接种18 d时出现肿瘤，肿瘤生长的速度快，肿瘤组织的直径大，NCIH-control组小鼠在接种25 d时出现肿瘤，肿瘤生长的速度慢，肿瘤组织的直径小，差异有统计学意义(图6)。

2.5 WB方法检测两组小鼠肿瘤组织中Foxp3表达量的差异结果如图7所示：NCIH-control组基本检测不到Foxp3的表达，NCIH-hFoxp3组有明显的Foxp3表达，而且随着肿瘤的生长表达量增加。

2.6定量PCR检测NCIH-hFoxp3和NCIH-control裸鼠肿瘤组织中IL-8和IL-10的表达结果如图8所示，在肿瘤长至7 d和13 d时，NCIH-hFoxp3组织中IL-8的表达低于对照组2倍以上，IL-10的表达高于对照组2倍以上，差异有统计学意义。

3　讨论

调节性T细胞(Treg)具有免疫抑制作用，最近的研究发现在肿瘤患者的癌灶局部有Treg聚集，这与肿瘤的进展和预后相关[4]。Treg可通过直接接触或释放抑制性细胞因子IL-10、TGF-β等[5]而抑制效应性T细胞的活化、增殖和功能，抑制NK细胞增殖及细胞毒效应等，从而促进肿瘤逃逸。

人们在多种谱系肿瘤细胞中也发现了Foxp3的表达，一些表达Foxp3的肿瘤细胞表现出和CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞相似的特性，可抑制效应性T细胞的增殖，从而逃避效应T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，因此认为Foxp3的高表达可能是这些癌细胞逃避免疫监视的一个新的机制[6，7]。

Foxp3的高表达对肿瘤细胞本身增殖及成瘤的影响，报道较少。我们建立高表达Foxp3的NCIH-hFoxp3肺癌细胞株，比较NCIH-hFoxp3和NCIH-control两组细胞增殖情况，我们发现高表达Foxp3的肺癌细胞增殖减慢。移植瘤裸鼠模型建立后我们发现，NCIH-hFoxp3组瘤组织出现早、生长快，这和体外实验相反，并且随着移植瘤生长时间延长，瘤内Foxp3表达增多。从这个现象，我们考虑和肿瘤形成的微环境有关。

本实验检测了肺癌细胞株培养上清中及转移瘤组织中IL-8、IL-10的表达，发现与NCIH-control组相比，NCIH-hFoxp3组细胞分泌的IL-8的含量明显降低，IL-10的含量明显升高，而转移瘤组织中也得到同样的结果。IL-10是一种重要的免疫负调控因子，能抑制T细胞向Th1细胞分化，我们推测NCIH-hFoxp3细胞通过高表达IL-10，进而抑制了效应T细胞的免疫功能。IL-8对特异性和非特异性的免疫细胞具有强烈的趋化作用，其中主要是对嗜中性粒细胞的趋化和激活作用，对淋巴细胞和嗜碱性粒细胞也有趋化作用，肿瘤组织内中性粒细胞浸润提示预后较好。所以我们推测，肿瘤局部微环境中IL-8低表达，对免疫细胞趋化作用减弱，抑制了免疫细胞的浸润，肿瘤细胞逃逸免疫杀伤容易形成移植瘤。有研究者发现用Foxp3 siRNA抑制胰腺肿瘤细胞的Foxp3表达后，肿瘤细胞分泌的炎性细胞因子IL-6和IL-8增高[8]，同我们的研究结果一致。但是裸鼠胸腺发育不良，高表达Foxp3的肺癌细胞对T细胞的作用无法显示，这是实验待改进的地方。

综上所述，我们得出结论，高表达Foxp3的肺癌细胞可以通过表达细胞因子改变肿瘤局部生长的微环境，逃逸免疫监视，而促进肿瘤细胞的成瘤和发展。

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[2]张飚.转录因子Foxp3在肿瘤细胞中的表达功能的研究进展[J].国际免疫学杂志,2014,37(1):49-51.

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[4]Feng LL,Wang X.Targeting Foxp3+regulatory T cells-related immune suppression for cancer immunotherapy[J].Chin Med,2010,123(22):3334-3342.

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[收稿2015-12-31修回2016-01-30]

(编辑张晓舟)

Enforced expression Foxp3 enhances proliferation and tumorigeneity of lung cancer cell

LIU Rui-Min，CHAO Wei-Xia,WANG Shao-Long,WANG Ming-Li,JIA Cai-Yun,BAI Hui-Ling,MA Yuan-Fang.

Key Laboratory of Cellular and Molecular Immunology,Institute of Immunology,Henan University,Henan Engineering Laboratory of Antibody Medicine，Kaifeng 475000,China

Objective:To determine the effects of enforced expression of Foxp3 in lung cancer cell with regards to proliferation and tumorgeneity.Methods: A stable subline NCIH-hFoxp3 was established by liopfectamin-mediated pcDNA plasmid transfection carrying exogenous hFoxp3.The growth curve and secrection of IL-8 and IL-10 of NCIH-hFoxp3 were evaluated using MTT and ELISA,respectively.The in vivo tumorigeneity was assessed as well by inoculation of NCIH-hFoxp3 subcutaneously in nude mice.Results: Lung cancer cell NCIH-hFoxp3 with enforced expression of Foxp3 proliferated slowly but exihited increased in vivo tumorgeneity compared with corresponding control subline.In addition,increased expression of hFoxp3 in NCIH-hFoxp3 augmented secretion and attenuated secretion of IL-8 and IL-10,respectively.Conclusion: Increased expression of Foxp3 may promote progression of lung cancer cell by change of cellular microenvironment and evasion of immune surveillance.

Foxp3;Overexpression;Proliferation;Tumorgeneity

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.016

刘瑞敏(1974年-)，女，硕士，副教授，主要从事肿瘤免疫的研究。

及指导教师：白慧玲(1964年-)，女，硕士，教授，硕士生导师，主要从事自身免疫性疾病的研究，E-mail:445950688@qq.com。

R392.12

A

1000-484X(2016)10-1481-04

①本文为河南省卫生厅2010医学科技攻关计划(2010003083)。