蛙骨骼肌检测紫色甘薯醇提物抗疲劳效应研究

熊　斌，　陶小丹，　王杨科

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.陕西理工大学 经济与法学学院， 陕西 汉中 723000；3.陕西省白河县高级中学， 陕西 安康 725800)



蛙骨骼肌检测紫色甘薯醇提物抗疲劳效应研究

熊斌1,3，陶小丹2，王杨科1

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.陕西理工大学 经济与法学学院， 陕西 汉中 723000；3.陕西省白河县高级中学， 陕西 安康 725800)

研究紫色甘薯醇提物对蛙骨骼肌收缩舒张的影响，筛选出蛙骨骼肌收缩曲线共性因子作为骨骼肌研究抗疲劳指标，为蛙骨骼肌作为初步检测抗疲劳物方法提供依据。将蛙神经-腓肠肌标本连接到张力换能器，刺激神经干，用生理信号采集系统记录相应的曲线。统计骨骼肌收缩曲线上TFmax50、Tmax、△T、STI、DTI、DTI50、DTI90、+dT/dtmax、-dT/dtmax、t-dT/dtmax，并做因子分析。设计小鼠体内实验，对蛙骨骼肌检测紫色甘薯醇提物抗疲劳效应的可靠性进行验证。因子分析提取5个因子成分，累计方差贡献率达到90.22%，较好地代替原始10个指标来评价紫色甘薯醇提物对蛙骨骼抗疲劳效应。因子1(DTI50、DTI90、TFmax50)可初步认定为综合因子，主要表现的是骨骼肌舒张持续时间。DTI50、DTI90、TFmax50在蛙骨骼实验组与空白组之间达到了极显著性差异(P<0.01)，表明紫色甘薯醇提物对蛙骨骼具有抗疲劳效应，与小鼠体内实验结论一致。因此，DTI50、DTI90、TFmax50能很好地反应紫色甘薯醇提物对蛙骨骼抗疲劳效应。

因子分析；蛙骨骼肌；紫色甘薯醇提物；抗疲劳

紫色甘薯，属旋花科(Convolvulaceae)，番薯属(Ipomoea)，是甘薯的新品种，学名Ipomoeabatatas(L.) Lam.，不仅营养丰富，而且有很好的保健功能[1-2]。现代研究发现，甘薯糖蛋白在人体内有特殊的生理作用[3-5]，如降血脂功能[6-8]、抗肿瘤作用[9]等。花青苷是紫色甘薯的主要功能成分，研究发现花青苷具有抗氧化及清除自由基、抗肿瘤、保护肝脏、抗高血糖血脂等诸多生理保健功能[10-20]，是当前的研究热点[21-24]。运动性疲劳是一种复杂的生理现象，可引起运动员运动能力下降，战士体能减退，对一般人群可导致工作效率降低，差错事故增多，严重影响人们的生产生活[25]。过度疲劳可能导致“过劳”“过度训练综合症”“慢性疲劳综合症”等[26]。

目前，抗运动性疲劳物的评价依据中华人民共和国卫生部颁布的《保健食品检验与评价技术规范》，规定以小鼠为研究对象，通过小鼠游泳实验、血清尿素、血乳酸、糖原为指标，评价受试物的延缓体力疲劳的活性。此过程涉及实验动物的饲养管理、血液生化指标检测，对实验条件、操作过程要求较为严格，成本较高，不适用于受试物的初步筛选。蛙坐骨神经-腓肠肌标本具有制作简单、检测快速、实验条件要求较低、实验成本低廉等优点。因此，分析提取骨骼肌的收缩曲线特性来研究抗疲劳效果，具有理论意义和现实意义。

本文以紫色甘薯醇提物为材料，用因子分析法筛选出紫色甘薯醇提物对骨骼肌抗疲劳的指标，评价蛙骨骼肌检测紫色甘薯醇提物抗疲劳效应的可行性。并用小鼠体内实验验证蛙骨骼肌检测紫色甘薯醇提物抗疲劳效应的有效性，以期为获得快速准确地评价抗疲劳物的方法提供基础资料。

1　材料与方法

1.1仪器及试剂

生理信号采集系统，成都仪器厂；张力换能器(JZ300型)，北京新航兴业贸有限公司；紫外可见分光光度计(UV-2550)，日本岛津仪器公司；真空冷冻干燥机LGJ-12，北京松源华兴科技发展有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生物有限公司；小鼠转轮式疲劳仪(YLS-10B)，济南益康科技发展有限公司；常规分析纯试剂。

1.2实验材料

购买市售牛蛙，挑选健壮个体，称重(272±25) g。常规方法制备神经腓肠肌标本，以牛蛙坐骨神经腓肠肌标本为研究对象。

1.3花青苷提取与测定

购买新鲜紫薯，45 ℃烘干，粉碎，低温保存。用75%的酒精，料液比1∶20，超声提取(45 ℃，功率80%)，浓缩干燥，紫外分光光度计测定浓度，避光低温保存备用。

1.4小鼠运动耐力实验

昆明种雄性小白鼠62只(购于第四军医大学，下同)，分成4组，设置阴性对照组(灌胃生理盐水)和3个浓度组(5、10、20 mg/mL)。第一周进行适应性训练(25 rpm，10 min，难度低，每天训练一次)，第二周正规训练(25 rpm，30 min，难度中，每天训练一次)，第三周加强训练(25 rpm，50 min，难度高，每天训练一次)。每次训练前3 h灌胃，自由取食。第21 d，进行力竭性跑步实验(25 rpm，难度中，力竭标准是每5 min电刺激20次，每次电刺激耐受3 s，电刺激电流1.5 mA)，记录力竭时间。21 d后摘除眼球采血，检测血液乳酸(LD)、丙二醛(MDA)、血清尿素(BUN)，并采集肝脏测定肝糖原含量。

1.5抗疲劳实验

实验设置浓度组0.12 mg/mL，处理10 min。将一只牛蛙两条腿的神经-腓肠肌标本分为两组，随机选取一只作为实验组，另一只用任氏液处理作为空白对照组。将蛙神经-腓肠肌标本连接到张力换能器，刺激神经干(连续正电刺激，强度1 V，波宽0.2 ms，频率30 Hz)，用生理信号采集系统记录相应的曲线，并统计TFmax50(曲线下降到最大值一半时时间)，Tmax(收缩过程最大张力)，△T(张力增量)，STI(收缩间期)，DTI(舒张间期)，DTI50(舒张50%间期)，DTI90(舒张90%间期)，+dT/dtmax(收缩时张力最大变化率)，-dT/dtmax(舒张时张力最大变化率)，t-dT/dtmax(肌肉开始收缩至发生dT/dtmax的间隔时间)等指标。

1.6统计分析

将TFmax50，Tmax，△T，STI，DTI，DTI50，DTI90，+dT/dtmax，-dT/dtmax，t-dT/dtmax作为因子，应用SAS 9.1.3软件作因子分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2　结果与分析

2.1紫色甘薯醇提物对小鼠抗疲劳效应研究

小鼠灌胃21 d后，测定运动能力和相应的生化指标见表1。紫色甘薯醇提物能提高小鼠的运动能力，同时降低血液中BUN、LD、MDA含量，提高糖原储备。可见，紫色甘薯醇提物具有抗疲劳效应。

表1　紫色甘薯醇提物对小鼠抗疲劳效应

注：统计学差异显著性水平：*，P<0.05；**，P<0.01。

2.2因子分析法分析紫色甘薯醇提物对蛙骨骼抗疲劳的影响

通过SAS 9.1.3对肌肉收缩曲线的特征指标做因子分析，得到TFmax50、Tmax、△T、STI、DTI、DTI50、DTI90、+dT/dtmax、-dT/dtmax、t-dT/dtmax指标的相关矩阵、特征根、方差贡献率、载荷矩阵。分析发现，TFmax50、Tmax、△T、STI、DTI、DTI50、DTI90、+dT/dtmax、-dT/dtmax、t-dT/dtmax之间存在较大的相关性，代表各个指标隐含的信息有一定的重叠，可用来做因子分析，见表2。Tmax与△T之间的相关性达到了0.96(P<0.01)，这与骨骼肌收缩曲线特征吻合。+dT/dtmax、-dT/dtmax代表骨骼肌收缩相反的过程，为负相关，与实际相符。

表2　相关矩阵

注：统计学差异显著性水平：*，P<0.05；**，P<0.01。

表3　特征根和方差贡献率

因子分析可以通过降维将具有错综复杂关系的变量综合为少数几个因子，且因子具备一定的实际意义[27]，因子的数量根据相关系数矩阵的特征根来判定，通常以方差来表达。本研究将骨骼肌收缩曲线的10个特征指标进行因子分析，得到各因子的方差贡献率(表3)。一般因子的方差贡献率>85%即可认为因子已包含了全部测量指标所具有的主要信息[39]。由表可见，提取的因子1、因子2，因子3、因子4、因子5方差贡献率分别为37.09%、18.29%、17.3%、10.47%、7.05%，累计方差贡献率达到90.22%，因此，可以认为这5个因子可以较好地代替原始10个指标来评价紫色甘薯醇提物对蛙骨骼抗疲劳效应。表4为因子的载荷矩阵，是协方差矩阵的最大特征值所对应的单位特征向量。由载荷矩阵可以得出，因素1主要与Tmax、DTI、DTI90等关系密切，表示的是曲线的峰值和舒张期时程变化。因素2主要与-dT/dtmax密切，代表了峰舒张期最大变化率。因素3，因素4主要与+dT/dtmax、t-dT/dtmax关系密切，表示与收缩最大变化率时程相关。

此外，因子1在大多数原始指标上都有较大的载荷，因子2、因子3、因子4分别在-dT/dtmax、+dT/dtmax、t-dT/dtmax指标上有较大载荷。除因子1可初步认定为综合因子外，因子2、因子3、因子4、因子5统计意义不显著。并且TFmax50、Tmax、△T、STI、DTI、DTI50、DTI90、+dT/dtmax、-dT/dtmax、t-dT/dtmax最终共性方差分别为0.88、0.90、0.94、0.71、0.79、0.90、0.89、0.629、0.84、0.86，大多数超过了85%，说明这个潜在因子能够较好的反应各指标的大部分信息。

表4　载荷矩阵

表5　紫色甘薯醇提物对蛙骨骼舒张期的影响

注：统计学差异显著性水平：*，P<0.05；**，P<0.01。

DTI50、DTI90、TFmax50实验组与空白组之间达到了显著性差异(见表5)，表明紫色甘薯醇提物对蛙骨骼具有抗疲劳效应，与小鼠实验结论一致。证明DTI50、DTI90、TFmax50能很好地反应紫色甘薯醇提物对蛙骨骼抗疲劳效应。

3讨论

骨骼肌受神经纤维的支配，因而能将神经信号转化为肌肉的收缩。这一过程涉及电信号—化学信号—电信号间的转换，以及最终变为骨骼肌收缩的机械变化。骨骼肌的活性主要依据其收缩的效能来评价。骨骼肌收缩的效能是产生张力或发生缩短，受前负荷、后负荷和骨骼肌收缩能力的影响。骨骼肌收缩能力与兴奋收缩耦联的各个环节密切相关，是决定肌肉收缩效能的内在因素。骨骼肌的收缩和舒张都是主动的耗能过程。机体快速灵活的运动依赖于骨骼肌的快速收缩和舒张。可见，运动性疲劳与骨骼肌收缩能力密切相关。

蛙坐骨神经-腓肠肌标本易于制作、保持活性较为持久，刺激易于控制、舒张收缩易于记录，常作为研究药物对神经、神经肌肉接头、骨骼肌影响的材料。有学者利用力学分析的思维，建立线弹性模型、超弹性模型以及黏弹性模型来分析骨骼肌收缩规律[28]。乔现福等[29]以蟾蜍离体坐骨神经腓肠肌标本为研究对象，利用不同频率的连续电刺激，在前负荷15 g状态下，以不同重复率的连续电脉冲连续刺激5 min，记录疲劳过程中肌肉收缩形式的变化趋势，统计疲劳后单收缩的Fmax、+dF/dtmax、-dF/dtmax、张力上升时程和张力下降时程，研究疲劳对蟾蜍骨骼肌舒张性能的影响。实验结果发现，随疲劳程度加重和疲劳时间延长，肌肉收缩形式从单收缩向不完全强直收缩过渡，再向完全强直收缩过渡；疲劳后-dF/dtmax降低比Fmax和+dF/dtmax降低更明显，张力下降时程延长比张力上升时程延长更显著，疲劳对骨骼肌舒张性能的影响比对收缩性能的影响更显著。因此，骨骼肌舒张性能指标可作为研究骨骼肌疲劳和抗疲劳理想的指标。肖业伟等[30]记录蟾蜍坐骨神经干动作电位和腓肠肌收缩曲线，测定骨骼肌出现疲劳的时间并加以比较，来评价黄芪、生脉和参附3种注射液在同一动物的整体抗疲劳实验中对骨骼肌收缩疲劳的影响，发现黄芪注射液、生脉注射液和参附注射液具有延缓骨骼肌疲劳的作用。

综上，刺激神经干使蛙坐骨神经-腓肠肌标本产生完全强直收缩模拟外周疲劳，因子分析得出以骨骼肌收缩曲线DTI50、DTI90、TFmax50为抗疲劳指标，证明紫色甘薯醇提物抗疲劳效应，方法可行有效。

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[责任编辑：魏 强]Study on frog skeletal muscle test the anti-fatigue effect of alcohol extract of purple sweet potato

XIONG Bin1,3,TAO Xiao-dan2,WANG Yang-ke1

(1.School of Bioscience and Engineering, Shaanxi Sci-Tech University, Hanzhong 723000, China;2.School of Economics and Law, Shaanxi Sci-Tech University, Hanzhong 723000, China;3.Senior Middle School of Baihe County, Baihe 725800, China)

To investigate extract effect of of purple sweet potato on frog muscle contraction and diastole and filtrate common factor in curve of frog muscle contraction and diastole foranti-fatigue, the most preliminary testing method of fatigue resistance was studied. Connecting the frog nerves-gastrocnemius muscle tension transducer, stimulating the nerve trunk, the curve of muscle contraction and diastole by physiological signal acquisition system. factor analysis is made by TFmax50, Tmax, △T, STI, DTI, DTI50, DTI90, +dT/dtmax, -dT/dtmax, t-dT/dtmax. According to the technical specification for inspection and evaluation of health food, mice experiments on anti-fatigue effect of alcohol extract of purple sweet potato is designed. Factor analysis extract 5 constituent factors, and the cumulative variance is 90.22%, which is a better substitution for the original 10 indexes to evaluate the anti-fatigue effect of alcohol extract of purple sweet potato by frog skeletal muscle. Factor 1 (DTI50, DTI90, TFmax50) can be initially identified as comprehensive factors, mainly for showing the duration of frog muscle diastole. DTI50, DTI90, TFmax50 in frog skeletal muscle reached significant difference between experimental group and the blank group (P<0.01), suggesting that alcohol extract of purple sweet potato by frog skeletal muscle is of great anti-fatigue effect and in agreement with the experimental conclusion in mice. DTI50, DTI90, TFmax50 can reflect of the anti-fatigue effect of alcohol extract of purple sweet potato on frog skeletal muscle. The results showed no difference from the test on mice.

factor analysis;frog skeletal muscle;alcohol extract of purple sweet potato;anti-fatigue

1673-2944(2016)05-0069-05

2016-06-30

2016-09-15

陕西省农业科技创新与攻关项目(2015NY156)；陕西省教育厅科研基金资助项目(13JS022)

熊斌(1988—)，男，陕西省安康市人，陕西理工大学硕士研究生，陕西省白河县高级中学教师，主要研究方向为动物生理生态；[通信作者]王杨科(1961—)，男，陕西省澄城县人，陕西理工大学教授，硕士生导师，主要研究方向为生理学、药理学。

Q955

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