UPLC法测定略阳天麻中天麻素

景　娴，　江　海,2,3,4，　陈　琛,2,3,4，　杜欢欢，　李晓东

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.陕西理工大学 中德天然产物研究所， 陕西 汉中 723000；3.陕西省陕南秦巴山区生物资源综合开发利用协同创新中心， 陕西 汉中 723000；4.陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心， 陕西 汉中 723000；5.陕西省略阳县中药材技术推广服务中心， 陕西 略阳 724300)



UPLC法测定略阳天麻中天麻素

景娴1，江海1,2,3,4，陈琛1,2,3,4，杜欢欢1，李晓东5

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.陕西理工大学 中德天然产物研究所， 陕西 汉中 723000；3.陕西省陕南秦巴山区生物资源综合开发利用协同创新中心， 陕西 汉中 723000；4.陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心， 陕西 汉中 723000；5.陕西省略阳县中药材技术推广服务中心， 陕西 略阳 724300)

建立了天麻中天麻素含量的超高效液相色谱紫外检测法，主要采用Waters Acquity-BEH C18柱(1.7 μm，50 mm× 2.5 mm)，以乙腈和0.1%甲酸为流动相，流速0.3 mL/min进行梯度洗脱，乙腈洗脱浓度和时间为：3%(0 min)—20%(3 min)—3%(4 min)—3%(5 min)，柱温30 ℃，进样量5 μL，检测时间5 min，二极管阵列检测器，检测波长220 nm。该色谱分析条件下，天麻素能达到较好的基线分离，检测时间为5 min，经方法学考察可知该方法可行性高，能准确分析天麻中的天麻素，方法快速、方便、准确可行。

UPLC；天麻；天麻素；测定；略阳

天麻(GastrodiaelataBl.)又名赤箭、定风草、水洋芋等，属兰科(Orchidaceae)天麻属(Gastrodia)，为兰科天麻属与密环菌特殊共生的多年生草本植物，是国家三级保护物种。天麻是一种名贵的中药材，药用部位为其块茎[1]，性甘、平，归肝经，中医认为其主要功效有熄风止痉、平抑肝阳、祛风通络。现代药理学研究显示天麻素具有增加中央及外周动脉血管顺应性，可降低外周血管阻力，增加心脑血管血流量，产生温和降压作用。在临床上广泛用于治疗心脑血管、微循环系统疾病，适用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫、抽搐、破伤风等病症，疗效显著，且无明显副作用[2]。天麻中的化学成分有天麻苷、天麻苷元、香荚兰醇、香荚兰醛、β-甾谷醇、对羟基苯甲酸、胡萝卜苷等23种[3-5]，其中以天麻素(Gastrodine，化学名为对-羟甲基苯-β-D-葡萄吡喃糖苷)为最主要活性成分[6]。

陕西省略阳县地处汉中盆地西端，北依秦岭，南临巴山，为北亚热带和暖温带过渡带。境内气候温和，雨量充沛，雨热同季，光照充足，为天麻资源的生长提供了良好条件。略阳天麻质量上乘，为地理标志保护产品。

天麻素含量的测定对于天麻的质量控制有着重要意义，主要分析方法有[7]：高效液相色谱检测法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)[8-9]、紫外分光光度法(Ultraviolet，UV)[10]、近红外光谱法(Near Infrared Spectroscopy，NIRS)[11]、高效毛细管电泳法(High Performance Capillary Electroporesis，HPCE)[12]、薄层色谱法[9]等。HPLC法测定天麻中多成分含量时，往往分析时间长，对于色谱分析条件要求较高，检测灵敏度低。超高效液相色谱技术(Ultra-High Performance Liquid Chromatography，UPLC)是近年来发展起来的新技术，具有高分辨率、高灵敏度、分析时间短、测定准确性强的优点，受到广大研究者的青睐。本研究重点开发超高效液相色谱技术，测定天麻中天麻素含量，为其质量控制提供快速可靠的检测方法。

1　仪器与材料

1.1仪器

Waters Acquity-UPLC，配PDA检测器(美国Waters公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；湘仪TD5A-WS台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；101-2AB型电热鼓风机干燥箱(上海实验仪器厂)；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)。

1.2材料

天麻(天麻样品采自陕西省汉中市略阳县，经陕西理工大学药用植物实验室杨培君教授鉴定，为兰科植物天麻的干燥块根)，天麻素对照品(中国食品药品检定研究院，纯度95.4%，批号：110807-201507)；乙腈(色谱纯，Fisher/飞世尔)；甲酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)。

2　实验方法

2.1色谱分析条件

表1　UPLC流动相梯度条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18(1.7 μm，50 mm×2.5 mm)，柱温30 ℃；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸；流速：0.3 mL/min，流动相梯度条件见表1。

2.2溶液的制备

2.2.1标准溶液的配制

精密称取天麻素对照品2 mg，用去离子水定容在10 mL容量瓶中，得到天麻素标准溶液母液0.2 mg/mL。

2.2.2样品溶液制备

取天麻样品粉碎成粗粉，在80 ℃下减压干燥1 h，粉碎，取粉末(过四号筛)精密称量1 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加100 mL去离子水超声提取40 min，静置放凉，摇匀定容至100 mL，4 000 r/min离心15 min取上清液经0.22 μm孔滤膜滤过，取滤液备用。

2.3波长检测与溶剂选择

2.3.1波长检测

取天麻素标准品溶液5 μL，注入超高效液相中，在PDA检测器下光谱扫描，选择最适检测波长。

2.3.2溶剂选择

按照2.2.2中的方法制备3组水提法和3组稀乙醇法提取的平行样，注入超高效液相中，选择最优提取方法。

3　实验结果与分析

3.1检测波长的确定

用二极管阵列检测器在200～400 nm间扫描，结果发现天麻素紫外最大吸收波长为220 nm，即本实验采用波长220 nm进行检测。

3.2标准工作曲线

天麻素在优化色谱条件下的分离色谱图见图1，从图中可以看出，天麻素标准品的色谱峰能够得到良好分离，且分离时间只需5 min。

图1　标准品UPLC色谱图

分别取2.2.1节中标准溶液母液各0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mL，用去离子水定容至10.0 mL容量瓶，得到梯度标准工作液。按2.1节中色谱条件进样分析，以天麻素组分峰面积为纵坐标，浓度(单位：μg/mL)为横坐标绘制标准工作曲线，得到天麻素线性回归方程y=251.897x+526.638(r=0.997 7)，线性范围4.300 0～24.600 0 μg/mL。在给定的浓度范围内，天麻素的相关系数r大于0.995，说明在该色谱条件下能够得到良好的线性关系。

3.3方法学考察

3.3.1稳定性实验

取同一样品，按2.2.2方法制备供试品溶液，将供试品溶液在25 ℃下放置0、4、8、12、24 h，在色谱分析条件下进样进行检测，计算出天麻素峰面积的RSD值为1.59%，表明供试品溶液在24 h内无显著变化，表明该方法稳定性良好。

3.3.2精密度实验

取同一样品的供试品溶液，连续重复进样5次，每次进样5 μL，计算出天麻素峰面积的RSD值为1.37%，表明该方法精密度良好。

3.3.3重复性实验

精密称取同一天麻样品，按2.2.2方法平行制备5份供试品溶液，按2.1色谱条件进行检测后计算天麻素峰面积的RSD值为1.62%，表明该方法具有良好的重复性。

3.3.4加样回收率实验

精密称取已知天麻素含量的1号天麻样品，共9份置于具塞锥形瓶中，按样品溶液的制备方法加入适量对照品制成低、中、高3个质量分数的加标供试品溶液，按色谱分析条件进样，测定，计算回收率。结果见表2。回收率结果显示，该方法加样回收率在98%～103.5%之间，平均回收率为100.01%，RSD为1.3%，方法稳定，准确。

表2　回收率及其RSD(n=3)

3.4样品含量分析

分别测量3种天麻中天麻素的含量，每个样品重复测定3次，按2.2.2中方法制备供试品溶液，在2.1中色谱条件下进行测量分析，结果见图2。根据3种天麻素峰面积，采用标准曲线法计算含量，结果见表3。

图2　天麻样品UPLC色谱图

样品标号天麻素平均含量/(mg·g-1)RSD值/%15.232.4124.151.5335.391.92

根据表3所测量的陕西省略阳县天麻中天麻素含量可知，3种略阳天麻产品中天麻素含量均符合我国对天麻素含量的要求，且品质良好。刘红等[13]用HPLC法所测得的毕节市各县的天麻中天麻素含量与闫宝庆等[14]用RP-HPLC法所测得的12个不同省市的天麻中天麻素含量与本实验所用UPLC法所测得略阳天麻中天麻素含量相比，均符合药典规定，且本实验所用的UPLC检测含量更高，精度更准。

4　小结与讨论

天麻素作为天麻中的主要活性成分，其含量的多少是评价天麻品质的重要指标之一。从本文的分析结果看，略阳天麻中天麻素含量均满足2015版药典要求，品质良好。

作为HPLC分析方法的一种突破，UPLC为中药这一多成分复杂体系的分析检测提供了一种新的强有力工具。此法与常用的HPLC法[15-16]相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度都明显优于HPLC，缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量，降低了分析成本，且分离度好、重复性好、准确简便。且此法已应用于其他中草药中的快速分析检测[17]。

本实验采用UPLC梯度洗脱分析，选用乙腈和0.1%甲酸作为流动相，其中乙腈梯度为3%(0 min)—20%(3 min)—3%(4 min)—3%(5 min)，检测波长为220 nm，使用Waters Acquity-BEH C18色谱柱(50 mm×2.5 mm，1.7 μm)，柱温为30 ℃。在该色谱条件下天麻样品中的天麻素与其他物质能够有效分离，检测时间为5 min，提高了分析效率，为汉中天麻的品质评价及掺伪鉴别提供了有力的技术支撑。实验中考察了以新版药典中规定的稀乙醇和去离子水为提取溶剂，分别用回流提取和超声处理，以及不同时间对天麻素进行处理，对测定结果综合分析后，最后采用去离子水超声提取40 min，天麻素的提取效率更高。

从样品的色谱图中可见，1.07 min物质为天麻素，天麻素与其他组分离彻底，后边还有5～6个比较大的色谱峰，这些色谱峰在该色谱条件下分离效果较好，这些峰分别代表何种物质，是否也是天麻的有效成分，具有何种生物学特性，还有待继续研究。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2015年版一部[M].北京：中国医药科技出版社,2015:58.

[2]于颖,樊光辉.天麻素的临床应用研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志,2012,10(9):1117-1118.

[3]ZHAO Yun-kun,CAO Qiu-e,XIANG Yan-qiao,et al.Identification and determination of active components in Gastrodia elata Bl. by capillary electrophoresis[J].Journal of Chromatography A,1999,849(1):277-283.

[4]YANG X D,ZHU J,YANG R,et al.Phenolic constituents from the rhizomes of Gastrodia elata[J].Natural Product Research,2007,21(2):180-186.

[5]王亚男,林生,陈明华,等.天麻水提取物的化学成分研究[J].中国药学杂志,2012,47(12):1775-1781.

[6]杜伟锋,陈琳,丛晓东,等.天麻化学成分及质量控制研究进展[J].中成药,2011,33(10):1785-1787.

[7]陈琛,李新生,周建军,等.天麻素提取纯化及检测技术研究进展[J].陕西理工学院学报:自然科学版,2013,29(3):69-74.

[8]任守利,刘塔斯,林丽美,等.HPLC测定不同商品规格天麻中天麻苷与天麻苷元的含量[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(15):55-58.

[9]保玉心,覃引.一种快速测定天麻素的方法[J].重庆文理学院学报:自然科学版,2012,31(4):65-68.

[10]杜伟锋,徐珊珊,王胜波,等.近红外光谱法测定天麻中天麻素的含量[J].南京中医药大学学报,2011,27(6):568-569.

[11]魏胜华,刘勇,伍和芳,等.高效毛细管电泳法测定全天麻胶囊中天麻素的含量[J].光谱实验室,2011,28(1):361-363.

[12]王孟,刘聪敏,王昌利.强力定眩片中天麻素含量的测定及薄层鉴别[J].现代中医药,2012,32(6):62-64.

[13]刘红,陈燕芹,罗树常,等.反相高效液相色谱法同时测定天麻中天麻素和3种核苷[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(17):81-83.

[14]闫宝庆,张晖芬,逄楠楠,等.RP-HPLC同时测定天麻中4种成分的含量[J].中国中药杂志,2009,34(22):2903-2905.

[15]肖远灿,董琦,迟晓峰,等.HPLC同时测定西藏栽培天麻中天麻素和8种核苷及碱基类成分[J].中国中药杂志,2014,39(19):3798-3802.

[16]王常顺,刘永利,王晓蕾.UPLC、HPLC测定血栓通注射液中5个皂苷类成分含量的比较研究[J].药物分析杂志,2013,33(9):1617-1620.

[17]陈斌,蔡涛,贾晓斌.UPLC同时测定蒸制三七中的10种人参皂苷类活性成分的含量[J].中国中药杂志,2014,39(9):1614-1619.

[责任编辑：魏 强]

Measurement of gasrtrodine content in Lueyanggastrodiaelataby UPLC

JING Xian1,JIANG Hai1,2,3,4,CHEN Chen1,2,3,4,DU Huan-huan1,LI Xiao-dong5

(1.School of Bioscience and Engineering, Shaanxi Sci-Tech University, Hanzhong 723000, China;2.Chinese-German joint Institute for natural product research, Shaanxi Sci-Tech University,Hanzhong 723000, China;3.Qinling-Bashan Mountains Bioresources Comprehensive Development C.I.C., Hanzhong 723000, China;4.Shaanxi Engineering Research Center of Tall Gastrodia Tuber and medical Dogwood,Hanzhong 723000, China;5.Technology Promotion Service Center of Lueyang’s Chinese Medicine, Lueyang 724300, China)

The study was performed to establish the UPLC method for measurement of gastrodine content ingastrodiaelata, The separation column was Waters Acquity BEH C18(1.7 μm, 50 mm×2.5mm).A gradient elution using acetonitrile (A)-methanoic acid(B,0.1%)as the mobile phase was chosen. Acetonitrile concentration gradient varied at different time,that is, 3%(0 min)—20%(3 min)—3%(4 min)—3%(5 min). Chromatographic parameters included a flow rate of 0.3 mL/min, a column temperature of 30 ℃, an injection volume of 5 μL, a detection time of 5 min, a wavelength of 220 nm and so on. The results obtained by UPLC showed that gastrodine could achieve good baseline separation effect under the chromatographic conditions. The methodology investigation indicated that this method is feasible, detecting time was reduced to 5 min. The method can accurately analyze the gastrodine and the method is rapid, convenient, and accurate.

ultra-high performance liquid chromatography(UPLC);gastrodiaelata;gastrodine;determination of content;Lueyang county

1673-2944(2016)05-0074-06

2016-07-26

2016-09-14

陕西省科技统筹创新工程计划项目(2015KTTSSF01-03，2015HBGC-18)；陕西省科学技术研究发展计划项目(2016XT-13)；陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心资助项目(QBXT-Z(P)-15-21)

景娴(1993—)，女，陕西省宝鸡市人，陕西理工大学硕士研究生，主要研究方向为资源食品加工利用技术；江海(1977—)，男，四川省西昌市人，陕西理工大学高级实验师，主要研究方向为资源生物的开发利用；[通讯作者]陈琛(1978—)，男，陕西省宝鸡市人，陕西理工大学副教授，硕士生导师，主要研究方向为天然产物研究与开发。

O657.32; R284.1

A