原代大鼠脑微血管内皮细胞培养方法的改进

徐平湘　齐　特　陆　莉　薛　明　肇玉明

(首都医科大学基础医学院药理系，北京 100069)



， E-mail：yumingzhao@ccmu.edu.cn

· 技术与方法 ·

原代大鼠脑微血管内皮细胞培养方法的改进

徐平湘齐特陆莉薛明肇玉明*

(首都医科大学基础医学院药理系，北京 100069)

血脑脊液屏障(blood brain barrier，BBB)是机体的内部屏障之一，由介于血循环与脑实质间的软脑膜、脉络丛的脑毛细血管壁和包于壁外的胶质膜所组成，是中枢神经系统的重要解剖结构基础[1]。血脑脊液屏障主要是由脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)和周细胞构成，星形胶质足突包绕毛细血管的外周，覆盖其95%～99%的表面积。其中，血管内皮细胞是构成血脑脊液屏障的关键组织细胞位点，存在结构复杂的紧密连接，且相对缺乏胞饮囊泡及窗孔，其能够阻止大多数内外源性物质透过血脑脊液屏障，BBB的通透性是药物分子发挥其中枢活性的决定性因素之一。药物是否能够在BBB上进行有效转运是药物进入脑组织和治疗脑部疾病的主要制约因素[2]。

内皮细胞在血脑脊液屏障中的重要性决定了其是构建药代动力学血脑脊液屏障体外药物评价模型时的关键因素[3]。目前，国内外BBB模型多采用脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养建立。因此，内皮细胞培养技术与方法是构建该模型的关键因素之一。目前国内外关于BMECs的分离方法有筛网法、酶消化法及组织块法等[4-6]，在提取的过程中常常需要Percoll梯度离心法，方法繁琐，而且由于Percoll液为无机溶液，会对内皮细胞造成损害，影响细胞的活性。同时，从组织中提取微血管段后，培养的包被剂也会对细胞的活性及形态产生影响。因此，BMECs在组织分离、提取及接种的过程中还有优化和改进的必要性。本实验室人员结合国内外报道[4-6]，在已有方法的基础上，在组织分离过程中采用3种酶联合消化法(胶原酶Ⅱ型、胶原酶/分散酶及DNA酶Ⅰ)，提取过程中利用差速离心替代Percoll梯度离心，采用内皮细胞专用培养液(endothelial cell medium，ECM)，对培养方法进行优化。并对比了鼠尾胶原与多聚赖氨酸作为包被剂下细胞的形态，为药代动力学血脑脊液屏障模型提供细胞平台。

1　材料与方法

1.1实验动物

12只雄性SD大鼠，鼠龄16 d，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK-(军)2012-0004。

1.2药品与试剂

牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)购自美国Amresco公司，ECM、内皮细胞生长添加剂(endothelial cell growth supplement, ECGS)、青霉素/链霉素混合液和胎牛血清均购自美国Sciencell公司，DMEM培养基及其他培养试剂购自美国Invitrogen公司。胶原酶Ⅱ型购自美国Gibico公司，胶原酶/分散酶及DNA酶Ⅰ(DNAse Ⅰ)购自美国Roche公司，0.2%(质量分数)鼠尾胶原由本实验室自行提取。 0.1%(质量分数)多聚赖氨酸(poly-L-lysine，相对分子质量70 000～150 000)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐 [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT] 购自美国Sigma公司。 CD31(PECAM-1)抗体购自美国Millipore公司(稀释比例 1∶250)，vWF抗体购自美国Santa Cruz公司(稀释比例1∶100)， Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG (稀释比例 1∶200)购自美国Invitrogen公司，Alexa Fluor 488标记抗小鼠IgG(稀释比例1∶200)、封闭用羊血清及免疫组织化学染色所用其他试剂均购自北京中山金桥生物技术有限公司。

1.3常用仪器

高性能无菌实验台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)，CO2恒温培养箱和便携式液氮生物容器(美国Thermo Fisher公司)，高压消毒锅(日本SANYO公司)，荧光显微镜Eclipse 80i(日本尼康公司)。

1.4细胞培养液的配制

ECM完全培养基：按照培养基说明书，配制含5%(体积分数)胎牛血清、1%(质量分数)青霉素/链霉素混合液和1%(体积分数)ECGS液的专业内皮细胞ECM完全培养基。

普通DMEM完全培养基：按照文献[5]报道方法，配制含20%(体积分数)胎牛血清，2 ng/mL 成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、100 μg/L肝素钠和1%(质量分数) 青霉素/链霉素混合液的普通DMEM高糖培养基。

1.5鼠尾胶原制备

取大鼠尾1条,75%(体积分数)乙醇消毒,剖开取出中间的尾腱,泡在0.1%(体积分数)醋酸中，4 ℃放置，并不时振荡，48 h后取上清，离心1 789(×g) 30 min,取上清,弃沉淀。分装上清(鼠尾胶原)4 ℃保存，用时以灭菌蒸馏水1∶20稀释。

1.6原代内皮细胞的分离、培养

1.6.1脑微血管段的分离

大鼠脱臼处死，无菌条件下剪开颅骨，将取出的大脑放入盛有冰冷磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)培养皿中，解剖去除间脑、海马、白质、灰质等，仅余大脑皮质，随后将大脑皮质在干燥的灭菌滤纸上滚动，粘除软脑膜及脑膜大血管后，用PBS漂洗3次，用剪刀剪成1 mm3大小糜状物，0.1%(质量分数)胶原酶Ⅱ型混匀后置于37 ℃孵箱中消化90 min，消化过程中每10 min晃动1次，以确保消化完全；常温离心111.8(×g)，离心8 min，弃掉上清液；消化产物加入2倍体积的20%(质量分数)BSA轻柔吹打10次左右，4 ℃ 1 000(×g)离心20 min，弃去中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀。沉淀聚集物中加入2 mL DMEM培养基轻柔吹打洗涤，常温111.8(×g)离心5 min，弃掉上清液，加入0.1%(质量分数)胶原酶/分散酶2 mL和2 kU/mL DNAse酶Ⅰ 30 μL分散沉淀物。产物放入37 ℃孵箱中消化1 h，常温55(×g)离心6 min，弃掉上清液。再次加入2 mL DMEM洗涤，轻柔吹打5次，常温离心111.8(×g)5 min，弃掉上清液，加入20%(质量分数)血清白蛋白2 mL轻柔吹打10次，4 ℃ 1 000(×g)离心20 min，弃掉上清液，获得微血管段。

1.6.2微血管段的纯化

微血管段提取后，加入12 mL ECM完全培养基轻柔吹打10次，在2个未经包被处理的60 mm培养皿中差速培养1 h，之后接种在经过0.2%(质量分数)胶原包被的25 cm2培养瓶，培养5～6 d后，以1∶3传代培养。

1.7原代内皮细胞鉴定

原代培养的内皮细胞及第三段培养的内皮细胞分别种植在经过胶原包被的玻璃片上，用0.01 mol/LPBS洗涤细胞3次，4% (质量分数)多聚甲醛室温固定15 min，固定后的培养细胞用0.01 mol/L PBS洗涤3次，用内皮细胞的特异性标志物CD31及vWF抗体进行免疫荧光共染色鉴定内皮细胞。染色步骤如下：5%(体积分数)的山羊血清室温封闭半小时，加入CD11b及vWF一抗混合液，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，加入Alexa Fluor 594及Alexa Fluor 488二抗混合液室温孵育1 h，PBS洗涤3次；将玻片扣于预先滴有含DAPI的封片剂的载玻片上，封片。

1.8内皮细胞纯度计算

在荧光显微镜下随机取5个视野以100倍放大情况下观察、拍照，镜下计数CD31与vWF双阳性细胞数和细胞总数。

1.9不同培养包被剂对培养的内皮细胞形态的影响

分别以0.2%(质量分数)胶原及0.1%(质量分数)多聚赖氨酸包被的25 cm2培养瓶，培养6 d，观察内皮细胞的形态，比较包被剂对培养的内皮细胞形态的影响。

1.10DNA酶在实验中的作用

在分离血管段的过程中，断裂的DNA与破碎的细胞交杂在一起，形成难以吹打的细胞团块，导致血管得率低下，影响血管段的提取及接种后内皮细胞从血管段爬出。目前文献[6]报道的分离脑微血管内皮血管段的方法多为不加DNA酶的胶原酶Ⅱ型和胶原酶/分散酶的两种酶消化方法。借鉴本团队之前原代神经元培养方法[7]，本研究在分离过程中加入了DNA酶Ⅰ，以降解断裂的DNA。同时，为了验证DNA酶在组织取材中的作用，本实验设定了不加DNA酶Ⅰ的处理组，对比观察原代培养 6 d之后的2种处理下细胞形态的差异。

1.11内皮细胞在ECM培养基与在DMEM培养基中生长情况的比较

将第3代内皮细胞接种在96孔板内，每孔5×102个细胞，用ECM培养基与DMEM培养基对比培养，利用光学显微镜观察形态学及MTT比色法观察细胞增生情况。

1.12统计学方法

2　结果

2.1原代培养内皮细胞形态学动态观察

经光学显微镜观察发现，分离获取的微血管段长短不一，表面光滑，折光性好，细胞呈现串珠样(图1A)；培养3 d后，在接种部位围绕微血管长出细胞，微血管段呈现“蜈蚣样”形态,细胞为短梭形(图1B)；培养5 d时，细胞以接种部位为中心不断增生形成聚体群，不同群落之间不重叠，呈现铺路石样(又称为“漩涡样”)形态(图1C)。

2.2内皮细胞纯度鉴定

利用CD31与vWF的抗体进行免疫荧光共染色(图2)，计数镜下双阳性细胞数和细胞总数，计算阳性细胞率。原代(图2A～2D)与第3代细胞(图2E～2H)阳性率均>99%，证明培养细胞为内皮细胞。第3代细胞在形态上保留了内皮细胞的短梭形，细胞聚合呈现“铺路石样”或“漩涡样”形态，表明经过传代后保留了内皮的特性。

2.3不同培养包被剂对培养的内皮细胞形态的影响

分别以0.2%(质量分数)胶原及0.1%(质量分数)多聚赖氨酸包被的25 cm2的培养瓶，接种24 h(1d)时，2种包被基质均可支持内皮细胞生长，且形态区别不明显(图3A和3C)；细胞培养6 d后，胶原包被的内皮细胞呈现漩涡态(图3B)，而多聚赖氨酸包被的培养瓶中细胞未见典型漩涡态(图3D),表明胶原作为包被材料更有利于内皮细胞保持固有细胞形状。

图1　原代培养微血管内皮细胞的形态学变化

On day 1, micro-vessels(→)were in different length while BMECs accumulated in bead-like (A). On day 3, surrounding the seeding site, BMECs proliferated from the micro-vessels (→)as centipede-like (B). On day 5, BMECs formed the typical curved ‘paving stone’ (→)(C). Magnification: 100 fold； BMECs：brain microvascular endothelial cells.

图2　利用CD31与vWF的抗体进行免疫荧光共染色鉴定内皮细胞纯度

A-D:images of primary cultured BMECs; E-H: images of third passage of BMECs; A， E: vWF; B，F：CD31; C，G：DAPI； Magnification: 100 fold；BMECs：brain microvascular endothelial cells.

图3　不同培养包被介质对内皮细胞形态的影响

Cells with the support of 0.2% collagen (upper panel) and 0.1% poly-l-lysine (lower panel), respectively. Morphology changes of BMECs on day 1 (A, C) and on day 6 (B, D). Magnification: 100 fold； BMECs：brain microvascular endothelial cells.

2.4DNA酶在实验中的作用

本研究发现，不加DNA酶Ⅰ的处理组，提取的微血管段明显少于经过DNA酶Ⅰ的处理组，并且在培养6 d后细胞排列紊乱，细胞最初接种位置部分细胞成团生长(图4A)；而经过DNA酶Ⅰ的处理，细胞相对排列有序(图4B)。证明在取材时候，DNA酶Ⅰ将断裂的DNA分解，便于消化物的吹打，有利于血管段的提取及后期细胞爬出并有序生长。细胞消化后计数，未加DNA酶Ⅰ的两种酶法，每个25 cm2的培养瓶可得到4.2×105个细胞，而经过DNA酶Ⅰ处理的细胞组可得到2.5×106个细胞，即经过DNA酶Ⅰ处理后细胞收率可提高至未处理的5.95倍，说明经过处理对培养方法的改进是有效的。

2.5内皮细胞在ECM培养基及DMEM培养基中生长情况的比较

如图5所示，在2种培养基中培养的细胞，从第2天开始，生长速度与第1天相比差异均有统计学意义(P<0.01)。两种培养基相比较，在DMEM普通培养基中，内皮细胞生长缓慢；在ECM培养基中，内皮细胞从第2天开始进入对数生长期，5天后达到增生高峰，且第5天时细胞融合度已经约为90%。并且与DMEM培养基相比，ECM培养基培养的细胞在第2天、第3天、第5天和第6天增生速度分别为在DMEM培养基中的1.82、1.96、2.36、2.32倍，差异有统计学意义(P<0.01)，说明作为内皮细胞的专用培养基，ECM培养基确实可显著增强内皮细胞活性及增生能力。

图4　DNAse Ⅰ在提取微血管段中的作用

Morphology changes of brain microvascular endothelial on day 6 with DNAse I (A) and with DNAse I treatment (B). Magnification: 100 fold.

图5　内皮细胞在普通DMEM完全培养基和ECM完全培养基中的生长差异

3　讨论

目前，国内外分离脑微血管段的方法主要为筛网法和两次酶分步消化法。通过筛网法细胞得率较低，且匀浆过程对细胞损伤较大，接种后难以存活；两次酶分步消化法所分离的细胞虽存活率和细胞得率都有所提高，但在血管段分离提取过程中，由于断裂的DNA与破碎的组织、细胞容易形成团块，一方面降低细胞的得率，另一方面接种后细胞容易成簇生长，影响细胞的状态。本实验室曾经根据文献[4]报道，摸索过筛网法，发现细胞存活率仅为30%，并且微血管段提取过程中容易形成不易吹打的团块，与文献[5]报道的现象一致。因此，本研究借鉴本团队原代神经元培养的经验，在血管段分离过程中，加入DNA酶Ⅰ优化分离方法。结果表明，经过DNA酶Ⅰ处理的消化产物，不易成团，容易吹打，接种后细胞排列有序，证实DNA酶Ⅰ的优化是必须且切实可行的。

经典的原代培养方法是利用Percoll液分离血管段。而Percoll液是无机盐溶液，这种方法会对血管段造成一定的损伤。本研究用差速贴壁法代替Percoll液，以完全培养基在未经包被的培养皿内，经过1 h的差速贴壁培养，利用血管段与成纤维及脑膜等杂细胞的贴壁速度与贴壁能力的不同，可达到杂细胞贴壁而血管段不贴壁的目的。并且差速培养过程对血管段并无损伤，之后转为包被后的培养瓶内培养，可提高细胞活性与纯度。

本研究使用了内皮细胞专用ECM培养基，此培养基含有内皮细胞培养所需的微量元素、氨基酸、生长因子等。同时，本研究所用的胎牛血清和青/链霉素均为该公司产品，用上述试剂按照说明书要求的比例配制的完全培养基为优化培养基，可保证内皮细胞的优势生长。在预实验中发现，如果用普通的DMEM培养基及胎牛血清配制的培养基，培养5 d时所得到的内皮细胞纯度仅为80%，而用ECM培养基则可大于99%；同时，生长曲线表明，用ECM完全培养基比普通培养基条件下培养的细胞生长速度显著增快，证明选用此培养基对方法的优化是必要的。

除了对培养方法的优化，本研究还比较了培养包被介质对细胞形态的影响。研究显示，胶原作为支持介质，内皮细胞更容易形成典型的铺路石样及“漩涡样”形态；而多聚赖氨酸生长的细胞相对杂乱，证实胶原更适合内皮的生长。

综上所述，本研究以胶原为包被介质，3种酶联合消化法(胶原酶Ⅱ型、胶原酶/分散酶及DNA酶Ⅰ)分离脑微血管段，利用差速贴壁法去除杂细胞并采用内皮细胞专用培养基的优化培养细胞的方法，可获得高纯度与高存活率细胞，为建立血脑脊液屏障模型提供了可靠有效的技术方法，为中枢系统的药理毒理学研究和药物评筛提供了技术支撑[8]。

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编辑孙超渊

国家自然科学基金(31570856，3157040726)，北京市自然科学基金(5152005)，北京市教育委员会科技计划一般项目基金(KM201610025003)，首都医科大学校长基金(2015JS13)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(31570856，3157040726), Natural Science Foundation of Beijing (5152005), Scientific Research Project of Beijing Educational Committee(KM201610025003), Capital Medical University Principal Foundation(2015JS13).

时间：2016-10-1610∶55

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1055.018.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.026]

2016-05-20)