当归贝母苦参颗粒质量标准研究*

李长天，张珺，吴国泰，石晓峰，邵晶，李威，刘永琦

（1.甘肃中医药大学，甘肃兰州730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，兰州730000；3.甘肃省医学科学研究院，兰州730070）

当归贝母苦参颗粒质量标准研究*

李长天1，2，张珺1，吴国泰1，2，石晓峰3，邵晶1，2，李威1，刘永琦1

（1.甘肃中医药大学，甘肃兰州730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，兰州730000；3.甘肃省医学科学研究院，兰州730070）

目的建立当归贝母苦参颗粒（当归、浙贝母、苦参）的质量标准。方法采用薄层色谱法对制剂中当归、浙贝母、苦参进行定性鉴别，采用高效液相色谱法测定当归贝母苦参颗粒中含阿魏酸、苦参碱量。结果当归、浙贝母、苦参薄层色谱鉴别方法专属性强、重现性较好；阿魏酸在0.0316～0.1296 μg范围内与峰面积呈良好线性关系（r=0.9998），平均回收率为101.620%，相对标准偏差（RSD）为1.070%；苦参碱在0.100 0～1.000 0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r= 0.9996），平均回收率为99.180%，RSD为2.040%。结论该法简便、灵敏、准确、重复性好，可作为当归贝母苦参颗粒的质量控制标准。

当归；浙贝母；苦参；阿魏酸；苦参碱；色谱法，薄层；色谱法，高压液相

当归贝母苦参颗粒是在东汉著名医学家张仲景创立的当归贝母苦参丸基础上根据现代制剂工艺制备的颗粒剂，由当归、浙贝母、苦参3味药材组成，方中当归补血活血，浙贝母化痰散结，苦参清热利湿，诸药相配共凑养血和血、清热燥湿、化痰散结之功效，主要用于肺癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌等疾病的治疗，已取得较好临床疗效［1-2］，目前，有关当归贝母苦参颗粒质量标准的研究尚未见报道。本研究采用薄层色谱法对当归、浙贝母、苦参进行定性鉴别，采用高效液相色谱法测定当归贝母苦参颗粒中含阿魏酸和苦参碱量，旨在为全面、有效控制当归贝母苦参颗粒质量提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1药物与试剂当归贝母苦参颗粒（批号20140603）由甘肃省医学科学研究院研制，阿魏酸对照品（批号110773-200611）、苦参碱对照品（批号110805-200508）、贝母素对照品（批号110751-201110）由中国食品药品检定研究院提供，甲醇试剂和乙腈试剂为色谱纯，其他试剂全部为分析纯，水为纯净水。

1.1.2主要仪器Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）、AE260万分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、CP225D型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）、KQ2200B超声清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司生产）、800型离心沉淀器（上海手术仪器厂）等。

1.2方法

1.2.1薄层色谱鉴别

1.2.1.1当归薄层色谱鉴别［3-4］取当归贝母苦参颗粒5 g研细，加1%碳酸氢钠溶液50.00 mL，超声提取1.0 h，3 500 r/min离心15 min，将上清液倾出，用稀盐酸调pH值为2～3，加乙醚20.00 mL振摇萃取2次，合并乙醚层，水浴蒸干乙醚，残渣加甲醇1.00 mL溶解后作为供试品溶液；按处方制备不含当归的阴性样品，按供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液；另取当归药材1 g，按供试品溶液制备方法制得药材对照溶液；再取阿魏酸加甲醇制成每毫升含1.0 mg的对照品溶液。按《中国药典》2010年版一部附录ⅣB试验方法分别吸取上述4种溶液各10 μL，点于同一硅胶GF254板上，以乙醚∶三氯甲烷∶甲酸（1∶5∶0.1）为展开剂，展开取出晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。

1.2.1.2苦参薄层色谱鉴别［4］取当归贝母苦参颗粒5 g研细，加蒸馏水30.00 mL，超声提取0.5 h，过滤，滤液移至分液漏斗中，加三氯甲烷40.00 mL、浓氨试液1.00 mL，振摇萃取，静置后收集三氯甲烷层，水浴蒸干溶剂，残渣加甲醇1.00 mL溶解后作为供试品溶液；按处方制备不含苦参的阴性样品，按供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液；另取苦参药材2 g，加乙醇20.00mL，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20.00 mL溶解后按样品处理法制成药材对照溶液；另取苦参碱适量加甲醇制成每毫升含1.0 mg的对照品溶液。按2010年版《中国药典》附录ⅣB试验方法分别吸取以上4种溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇∶浓氨（8∶1∶0.1）为展开剂，展开取出晾干，喷以稀碘化铋钾溶液。

1.2.1.3浙贝母薄层色谱鉴别［3-4］取当归贝母苦参颗粒5 g研细，加蒸馏水30.00 mL，超声提取0.5 h，移至分液漏斗中加三氯甲烷40.00 mL，浓氨试液1.00 mL，振摇萃取，静置后收集三氯甲烷层，水浴蒸干溶剂，残渣加甲醇1.00 mL溶解后作为供试品溶液；按处方制备不含浙贝母的阴性样品，按供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液；另取浙贝母药材2 g，加乙醇20.00 mL，超声提取30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20.00mL溶解后按样品处理法制成药材对照溶液；再取贝母素乙加甲醇制成每毫升含1.0 mg的对照品溶液。按《中国药典》2010年版附录ⅣB试验方法分别吸取上述4种溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯∶甲醇∶浓氨∶水（4∶2∶1∶0.1）为展开剂，展开取出晾干，喷以稀碘化铋钾溶液。

1.2.2含苦参碱量测定［5-6］

1.2.2.1色谱条件色谱柱为Thermo BETASIL C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；乙腈∶水（27∶73）为流动相；220 nm处检测；流速为1.0 mL/min；柱温为40℃；按苦参碱峰计算理论板数不低于3 000。

1.2.2.2对照品制备精密称取苦参碱适量加甲醇配制成每毫升含0.2 mg的溶液，即可。

1.2.2.3供试品制备取当归贝母苦参颗粒适量研细，精密称取1.0 g置于锥形瓶内，加入氨试液1.00 mL，精密加入三氯甲烷20.00 mL，密塞，称定质量，超声提取0.5 h，再次称质量，用三氯甲烷补足缺失的质量，过滤，滤液转移至分液漏斗中，静置后放出三氯甲烷溶液，精密吸取2.00 mL，蒸干，残渣用甲醇溶液溶解，并转移至10.00 mL容量瓶中，加甲醇溶液至刻度，滤过，取续滤液即为供试品溶液。

1.2.2.4阴性对照品制备按当归贝母苦参颗粒处方工艺制备不含苦参的阴性样品，按“1.2.2.3”项的方法制备阴性对照品溶液。

1.2.2.5线性关系考察精密吸取“1.2.2.2”项制备的溶液2.50 mL，置5.00 mL于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得0.10 mg/mL对照品溶液。分别精密吸取0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL至1.00 mL容量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，各进样20 μL，按“1.2.2.1”项色谱条件测定峰面积，并以为苦参碱浓度为横坐标、峰面积值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.2.6精密度研究精密吸取“1.2.2.2”项制备的溶液20 μL，连续进样6次，计算苦参碱峰面积。

1.2.2.7稳定性研究精密吸取“1.2.2.3”项制备的溶液20 μL，按“1.2.2.1”项色谱条件分别于0、2.0、4.0、6.0、8.0、24.0 h进样测定含苦参碱量。

1.2.2.8重复性研究取当归贝母苦参颗粒适量研细，精密称定6份，每份1.0 g，按“1.2.2.3”项的方法制成供试液，进样测定含苦参碱量。

1.2.2.9加样回收率研究取当归贝母苦参颗粒适量研细，精密称定6份，每份0.5 g，分别向每份中加入苦参碱溶液（0.99 mg/mL）1.00 mL，按“1.2.2.3”项的方法制备，进样20 μL，测定峰面积，计算含苦参碱量。

1.2.2.10样品含苦参碱量测定按“1.2.2.3”项的方法制备不同批号供试品溶液各3份，按“1.2.2.1”项色谱条件测定含苦参碱量，计算平均值。

1.2.3含阿魏酸量测定［7-10］

1.2.3.1色谱条件色谱柱为Thermo BETASIL C18柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；乙腈∶0.1%磷酸水溶液（20∶80）为流动相；316 nm处检测；流速为1.00 mL/min；柱温为30℃；以阿魏酸峰计算理论塔板数不低于3 000。

1.2.3.2对照品制备精密称取阿魏酸0.005 1 g，加70%甲醇定容至5.00 mL的容量瓶中制成对照品储备液。精密吸取储备液0.10 mL移至25.00mL容量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，得每毫升含4.080 0 μg的溶液，即可。

1.2.3.3供试品制备取当归贝母苦参颗粒适量研细，精密称取2.0 g置于锥形瓶中，加70%甲醇溶液（含5%甲酸）20.00 mL，称质量，超声提取1.0 h，放置后补足缺失的质量，所得提取液按3 000 r/min离心15 min，取上清液5.00 mL，用70%甲醇定容至10.00 mL作为供试品溶液。

1.2.3.4阴性对照品制备按当归贝母苦参颗粒处方工艺制备不含当归的阴性样品，按“1.2.3.3”项的方法制备阴性对照品溶液。

1.2.3.5线性关系考察分别精密吸取“1.2.3.2”项溶液50、100、200、400、600、800μL，用70%甲醇定溶至1.00mL，分别吸取上述溶液20 μL，按“1.2.3.1”项色谱条件测定，以峰面积（Y）为纵坐标、阿魏酸浓度（X）为横坐标进行线性回归。

1.2.3.6精密度研究精密吸取“1.2.3.2”项制备的阿魏酸溶液20 μL，进样6次，计算阿魏酸峰面积。

1.2.3.7稳定性研究精密吸取“1.2.3.3”项制备的阿魏酸溶液20 μL，按“1.2.3.1”项色谱条件分别于0、2.0、4.0、6.0、8.0、24.0 h进样测定含阿魏酸量。

1.2.3.8重复性研究取当归贝母苦参颗粒约2.0 g研细，精密称取6份，按“1.2.3.3”项的方法制备成供试液，进样测定含阿魏酸量。

1.2.3.9加样回收率研究取当归贝母苦参颗粒约2.0 g研细，精密称定6份，分别加入阿魏酸对照品溶液（0.079 mg/mL）200 μL，按“1.2.3.3”项的方法制备，进样20 μL，测定峰面积，计算含阿魏酸量。

1.2.3.10样品含阿魏酸量测定按“1.2.3.3”项的方法制备不同批号供试品溶液各3份，按“1.2.3.1”色谱条件测定含阿魏酸量，计算平均值。

2　结果

2.1线性关系苦参碱回归方程：Y=30.424 6X+17.819 4，r=0.999 6。苦参碱在0.100 0～1.000 0 μg范围内与峰面积线性关系良好。阿魏酸回归方程：Y=65.5577X-0.0344，r=0.999 8。阿魏酸在0.031 6～0.129 6 μg范围内与峰面积线性关系良好。

2.2精密度苦参碱相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.034%。阿魏酸RSD为0.843%。

2.3稳定性苦参碱、阿魏酸RSD均为1.760%，供试溶液均在24.0 h内稳定。

2.4重复性平均含苦参碱量为1.988 0 mg/g，RSD为1.330%（n=6）；平均含阿魏酸量为7.560 0 μg/g，RSD为2.200%（n=6）。重复性均良好。

2.5加样回收率苦参碱平均加样回收率为99.180%，RSD为2.040%。阿魏酸平均加样回收率为101.620%，RSD为1.070%。

2.6薄层色谱鉴别结果当归、苦参、贝母供试品色谱中分别在与其药材及对照品色谱相应位置上显示相同颜色荧光斑点，斑点清晰，分离效果好，阴性样品无干扰，该法专属性良好，见图1～3。

图1　当归薄层色谱鉴别结果

图2　苦参薄层色谱鉴别结果

图3　浙贝母薄层色谱鉴别结果

2.7样品含苦参碱量苦参碱吸收峰分离良好，平均含苦参碱量为2.029 mg/g，RSD为1.250%，见图4。

图4　样品含苦参碱量测定

2.8样品含阿魏酸量阿魏酸吸收峰分离良好，平均含阿魏酸量为7.340 0 μg/g，RSD为1.290%，见图5。

图5　样品含阿魏酸量测定

3　讨论

当归贝母苦参颗粒由当归、浙贝母和苦参3味药材组成，原方见于张仲景《金匮要略》的当归贝母苦参丸，方中当归养血活血润燥，浙贝母利肺气解郁，苦参清热利湿，除热结；当归辛以润之，苦参苦以泄之，浙贝母入肺经，开郁利气，使其通调水道下输膀胱，为水出高源之义，符合中医认为肿瘤的病因病机是虚、痰、毒、瘀因素共同作用的观点，诸药相配共凑养血和血、清热燥湿、化痰散结之功效［2，11］。

现代医家将当归贝母苦参丸应用于肺癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌等疾病的治疗取得较好疗效［12-13］。本研究应用现代提取分离技术和制剂技术将传统当归贝母苦参丸制成颗粒，选择阿魏酸和苦参碱作为当归贝母苦参颗粒的定量指标，结合当归、浙贝母和苦参的薄层色谱鉴别，能有效控制当归贝母苦参颗粒的质量，方法简单易行，重现性较好，适宜用于当归贝母苦参颗粒的质量控制。

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Study on quality standard for Danggui Beimu Kushen Granules*

Li Changtian1，2，Zhang Jun1，Wu Guotai1，2，Shi Xiaofeng3，Shao Jing1，2，Li Wei1，Liu Yongqi1
（1.Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou，Gansu 730000，China；2.Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of Traditional Chinese Medicine in Gansu Province，Lanzhou，Gansu 730000，China；Gansu Provincial Academic Institute for Medical Research，Lanzhou，Gansu730070，China）

ObjectiveTo set up the quality standard for Danggui Beimu Kushen Granules.MethodsTLC was applied to qualitatively identify Angelica sinensis，Fritillaria thunbergⅡ，Sophora flavescens and HPLC was applied to quantitatively determine ferulic acid and matrine in the preparation.ResultsThe TLC identification method of Angelica sinensis，Fritillaria ThunbergⅡand Sophora flavescens had strong specificity and good reproducibility；ferulic acid showed good linear relation in the range of 0.031 6～0.129 6 μg（r=0.999 8）.The average recovery rate of ferulic acid was 101.620%，and RSD was 1.070%；matrine showed good linearity with the peak area in the range of 0.100 0～1.000 0 μg（r=0.999 6）.The average recovery rate was 99.180%and RSD was 2.04%.ConclusionThis methods are simple，sensitive and accurate with good reproducibility，and can be used as the quality control standard of Danggui Beimu Kushen Granules.

Angelica sinensis；Fritillaria thunbergⅡ；Sophora flavescens；ferulic acid；Matrine；Chromatography，thin layer；Chromatography，high pressure liquid

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.12.003

A

1009-5519（2016）12-1785-04

甘肃省财政厅科研业务费资助项目（BH-2013-25）。

李长天（1971-），副教授，硕士研究生导师，主要从事基础医学及中药研发的教学与科研工作。

（2016-01-25）