河南省部分地区人群散发戊型肝炎流行病学及病毒基因型分析*

刘霞，王帅，武跃明，司海超，王婷，司伏生

（1.江苏大学医学院，江苏 镇江 212013；2.南阳医学高等专科学校医学技术系，河南 南阳 473000；3.河南省南阳市中心医院麻醉科，河南 南阳 473000）

河南省部分地区人群散发戊型肝炎流行病学及病毒基因型分析*

刘霞1，王帅2，武跃明2，司海超3，王婷2，司伏生2

（1.江苏大学医学院，江苏 镇江 212013；2.南阳医学高等专科学校医学技术系，河南 南阳 473000；3.河南省南阳市中心医院麻醉科，河南 南阳 473000）

目的研究分析河南省南阳地区散发戊型肝炎的流行病学特征及流行毒株的基因型。方法在对目标人群的戊型肝炎流行病学调查过程中，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）对采集到的血清样本进行抗体检测，对其中抗体为阳性的戊型肝炎病例，通过巢式PCR（nested R T-PCR）方法，扩增基因组OR F2区域150bp的片段并进行测序及生物信息学分析。结果本研究采集到的1100份血清样品中有295份血清戊肝抗体阳性，阳性率26.8%。男女戊肝患病比为1.86︰1，戊肝患者中男性多于女性，80.3%的患者集中在35岁及以上的年龄组。HEV R NA检测表明128份血清阳性，阳性率43.4%，病毒序列在分型上属于基因4型，与中国西安株的核苷酸序列同源性最高。结论南阳地区的戊肝以散发为主，基因4型是该地区的优势基因型。本地区戊肝的亲缘关系与中国西安株最近，推断两地毒株可能来源于戊肝病毒的同一种系。

戊型肝炎；病毒；流行病学；基因

戊型肝炎（hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）感染而引起的急性自限性病毒性肝炎，主要经粪口途径传播，引起戊型肝炎（HE）的流行和散发。戊型肝炎是个新发的全球性疾病，在世界上越来越多的国家发生和流行[1-2]。人对HEV普遍易感，病人发病症状严重，病死率高，青壮年戊肝病死率可达1%～2%，远较其他各型肝炎高，妊娠妇女患HEV的死亡率高达10%～25%，给人类健康造成严重威胁[3]。我国为HEV流行区，1986～1988年在我国南疆地区曾发生过戊肝的大流行，并造成707例死亡，对人类健康造成了严重威胁[4]。河南省未发生过戊肝的暴发流行，但近年来散发病例逐渐增多。由于HEV基因组自身的特点及其准种现象的存在[5]，不同地区HEV的序列变异情况较大并且具有地方特异性，因此国内外的研究结果并不能完全代表河南省的具体情况。本研究对HEV在河南省的流行情况及其基因组的序列进行分析，以便研究其序列变异情况并为有效地监控该病提供理论性参考。

1 材料与方法

1.1试剂及仪器

1.2标本来源

本研究中血清样品主要来源于南阳、信阳及郑州3地，为2013年1月-2013年12月住院治疗的肝炎病患者血清样本。此外，还有南阳市疾病预防控制中心对下辖区县检测到的急性黄疸及肝功能异常人群的血清样本。对所获得的样本按照性别、年龄、临床症状及既往病史等进行详细的登记调查。

1.3抗体检测

对收集到的血清首先进行抗HEV IgG抗体的检测，抗体检测试剂盒购自北京万泰药业股份有限公司，详细检测步骤及结果判定标准严格按照说明书所要求的进行。

1.4引物设计及合成

对HEV抗体阳性的血清样品进行病毒RNA的提取并进行扩增。根据文献报道，利用DNA star和Primer 5.0软件，选择HEV ORF2区域作为RT-nPCR及基因分型引物，该引物公认能够扩增HEV多个基因型的毒株，PCR产物大小为150 bp。引物序列如下：外引物：H1（5'-CTGTTTAAYCTTGCTGACAC-3'），H2（5'-WGARAGCCAAAGCACATC-3'）；内引物：H3（5'-GACAGAATTGATTTCGTCG-3'），H4（5'-TGYTG GTTRTCRTAATCCTG-3'）。引物由上海生工有限公司进行合成。

1.5RNA的提取及扩增

抗体阳性血清用TRIZOL Reagent进行裂解后提取病毒RNA，最后溶解到DEPC水中。然后以病毒RNA为模板用M-MLV Reverse Transcriptase和Prime STAR HS DNA polymerase进行RT-PCR反应，合成病毒cDNA。PCR反应条件和程序参考说明书进行，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测确认。

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1.6基因克隆、测序及遗传进化分析

用胶回收试剂盒对经琼脂糖凝胶电泳确认后的片段进行纯化回收，目的DNA连接至T载体后转化大肠杆菌DH5α，涂布平板过夜生长后挑取克隆进行质粒提取，获得的质粒送华大基因进行测序。测得的序列用CLUSTAL-W（version 1.8）进行序列比对，计算核苷酸序列的同源性，用Mega 4.0绘制构建遗传进化树。

2 结果

2.1HEV IgG抗体检测

本研究中，河南的南阳（980）例、信阳（60）例、郑州（60）例，3地共采集到肝炎患者血清1 100份，经抗体检测，戊肝抗体阳性病例295例，占总数的26.8%。其中南阳、信阳、郑州的戊肝病例数分别为272例、10例和13例，戊肝占各地肝炎患者病例分别为27.8%、16.7%和21.7%，信阳地区的戊肝病例比例低于其他两个地区。

2.2戊肝病例年龄及性别分布特征

295例戊肝患者中，男性192例，女性103例，男︰女=1.86︰1。在戊肝患者中年龄最小18岁，最大的为68岁，80.3%的患者集中在35岁及以上的年龄组（见附表）。尤其以40～60岁年龄组占多数（58%）。

附表　戊肝病例的年龄与性别分布特征

2.3戊肝发病季节分布特征

2013年全年确定的295例戊肝病例中，在全年每个月份都有发生。61.7%的病例集中在前5月份和11、12月份之间（见图1）。戊肝病例在季节分布上，从11月份开始逐步增多，直至到5月份，其中4月份的戊肝发病数达到最高峰。

图1　2013年1～12月戊肝发病时间分布特征

2.4PCR产物的扩增、测序及遗传进化分析

本研究中对295份戊肝抗体阳性的患者血清标本进行HEV RNA检测，阳性病例128例，阳性率43.4%。扩增出的目的片段均送上海生工测序，进行序列分析及BLAST比对。结果表明128份样品中，全部为基因4型病例，阳性率达100%，进一步表明河南省南阳市戊肝患者的基因型以4型为主。

用DNA star（version 7.0）和CLUSTAL-W（version 1.8）软件对来国内主要省份及国外代表性毒株基因组本区段的核苷酸同源性进行比较。去除重复性的序列，本研究选取其中3株代表性的毒株用Mega 4.0绘制构建遗传进化树。结果表明，本研究中的扩增序列与中国的西安分离株JKO-Chi Sai 98C（ac cession number：AB197673）在同一进化分支上，同属于基因4型，进一步提示南阳市散发戊肝病例的基因型主要是4型，且基因4型是本地的优势基因型和主要致病毒株（见图2）。

图2　HEV代表性毒株和参考序列基于ORF2 150 bp片断构建的进化树（●为本文分离株）

3 讨论

近年来的验证表明，戊型肝炎由原来的在亚洲、非洲等发展中国家的暴发流行逐渐转变为全球范围内的散发流行，成为威胁全球人类健康的一个世界性问题[1]。最近的研究表明，在无偿献血者的血液中及器官移植患者体内都发现有感染HEV的报道[6-11]，并且出现甲肝和戊肝的混合感染[12]。为了研究河南省南阳市的戊肝流行情况本研究进行了连续12个月的戊肝病例筛查，共发现戊肝病例295例。本研究表明，年龄与性别是戊肝感染的影响因素。本研究戊肝患者中年龄最小18岁，最大的为68岁，80.3%的患者集中在35岁及以上的年龄组。在关于戊肝发病男女性别比的报道中，不同研究者有不同的说法，如最新研究中有报道戊肝患者男女之比为1.85︰1[13]，2.99︰1[14]，1.58︰1[15]。本研究中戊肝患者男女之比为1.86︰1，支持男性比女性更易感戊肝的结论。戊肝患者中男性多于女性，80.3%的患者集中在35岁及以上的年龄组，可能原因是：随着人群年龄的增长，其活动范围越来越大，生活方式也越来越多样化，因此感染戊肝的几率也就越来越大。此外，季节也是戊肝感染率变化的一个影响因素。本研究中的戊肝病例呈全年散发，前5个月和11、12月份是戊肝的高发季节，占全年发病总数的61.7%。

为了初步调查河南其他地区的戊肝流行情况，笔者从河南省会郑州市和南阳市临近的信阳市各采集60份血清样品，调查结果显示郑州市和信阳市的戊肝阳性率分别为21.7%和16.7%，低于南阳市的27.8%。这可能和南阳市人口多，人员流动性大，生活方式多样化有一定的关系。为了进一步查明南阳市流行的戊肝基因型，笔者对295份戊肝抗体阳性的患者血清标本进行HEV RNA检测，阳性病例128例，阳性率43.4%。扩增出的目的片段经测序BLAST比对后发现全部为基因4型，与近年来国内主要流行毒株基因型一致。

在核苷酸的同源性方面，本研究中分离到3株病毒株NY-1、NY-2、NY-3与中国分离株CCC220（长春株）、JYI-Chi Sai 01C（上海株）和JKO-ChiSai 98C（西安株）在同一进化分支上。其中与西安分离株JKO-ChiSai98C（accession number：AB197673）的亲缘关系为最高，同属于基因型4型。说明分离到的病毒株较为稳定，未发生较大的变异情况。地理分布上南阳与西安有较近的地缘关系，人员往来较为频繁，这为病毒在两地的快速传播提供了较为便利的条件。

本研究通过一年的监测，对南阳市戊肝的流行情况进行初步的研究，调查结果表明南阳市的戊肝患者以散发为主。选取代表性毒株进行序列比对发现，本地感染人的戊肝基因型为4型。该结果将为以后更好的防控该病提供重要理论参考。

[1]KHUROO M S.Hepatitis E:an emerging global disease-from discovery towards control and cure[J].Journal of Viral Hepatitis, 2016,23(2):68-79.

[2]DALTON H R,KAMAR N,IZOPET J.Hepatitis E in developed countries:current status and future perspectives[J].Future Microbiology,2014,9(12):1361-1372.

[3]REIN D B,STEVENS G A,THEAKER J,et al.The global burden of hepatitis E virus genotypes 1 and 2 in 2005[J].Hepatology,2012,55(4):988-997.

[4]JIA Z,YI Y,LIU J,et al.Epidemiology of hepatitis E virus in China:results from the Third National Viral Hepatitis Prevalence Survey,2005-2006[J].PLoS ONE,2014,9(10):e110837.

[5]GRANDADAM M,TEBBAL S,CARON M,et al.Evidence for hepatitis E virus quasispecies[J].Journal of General Virology,2004, 85(Pt 11):3189-3194.

[6]TENDULKAR A A,SHAH S A,KELKAR R A.A case of Hepatitis E in a blood donor[J].Asian J Transfus Sci,2015,9(1): 82-84.

[7]MA L,SUN P,LIN F,et al.Prevalence of hepatitis E virus in Chinese blood donors[J].Journal of International Medical Research,2015,43(2):257-262.

[8]RAMSAY I,SNELL L,SHARMA V,et al.Liver transplantation for acute liver failure because of genotype 3 hepatitis E virus infection[J].Liver Transplantation,2015,21(12):1557-1559.

[9]ANDERSSON MI,STEAD P A,MAPONGA T,et al.Hepatitis E virus infection:An underdiagnosed infection in transplant patients in Southern Africa[J].Journal of Clinical Virology,2015,70:23-25.

[10]TRAORE K A,OUOBA J B,ROUAMBA H,et al.Hepatitis E virus prevalence among blood donors,ouagadougou,burkina faso[J]. Emerging Infectious Diseases,2016,22(4):755-757.

[11]KURIHARA T,YOSHIZUMI T,ITOH S,et al.Chronic hepatitis E virus infection after living donor liver transplantation via blood transfusion:a case report[J].Journal of Surgical Case Reports,2016,2(1):32.

[12]HESAMIZADEH K,SHARAFI H,KEYVANI H,et al.Hepatitis Avirus and hepatitis Evirus seroprevalence among blood donors in Tehran,Iran[J].Hepatitis Monthly,2016,16(1):e32215.

[13]王国玲,谭锦花,刘青连,等.广州市海珠区2004-2013年甲、戊型病毒性肝炎流行特征分析[J].热带医学杂志,2014,7:934-936.

[14]王智,姜仁杰,李长城,等.盐城市2010-2014年戊型肝炎流行病学特征分析[J].江苏预防医学,2016,1:71-72.

[15]孙凤妹.2013年无锡市锡山区传染病疫情分析[J].预防医学情报杂志,2016,1:45-47.

（张蕾编辑）

Epidemiological and genotype analysis of sporadic Hepatitis E in some parts of Henan*

Xia Liu1，Shuai Wang2，Yue-ming Wu2，Hai-chao Si3，Ting Wang2，Fu-sheng Si2
（1.School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212013，China；2.Department of medical technology，Nanyang Medical College，Nanyang，Henan 473000，China；3.Anesthesiology Department，Nanyang Central Hospital，Nanyang，Henan 473000，China）

Objective To investigate the epidemiological characteristics of the sporadic Hepatitis E infection cases in Nanyang area.Methods In the investigation process of the target population，ELISA was used to detect the antibodies in the collected serum samples.The 150bp fragments of the ORF2 were amplified from the positive samples by nested RT-PCR and the target fragments were sequenced and analyzed.Results 295 of 1100 serum samples were HEV antibody positive，and the positive rate was 26.8%.Sporadic hepatitis E cases of 80.3%occurred with age over 35，and the male to female ratio was 1.86：1.A total of 128 serum samples were HEV RNA positive，and the viral sequences belonged to the genotype 4 with the maximum homology to Xi'an isolate.Conclusions Hepatitis E sporadic in Nanyang area and genotype 4 is the predominant strain in the city.The strains isolated in Nanyang have the closest relationship with Xi'an isolate，and this maybe infer that these two strains probably originate from the same HEV strain.

Hepatitis E；Virus；Epidemiology；Genotype

R 512.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.20.003

1005-8982（2016）20-0012-04

2016-05-09

河南省教育厅科学技术研究重点项目资助（No：13B310179）

司伏生，E-mail：mr.fusheng@163.com