线粒体功能对辅助生殖技术的影响

姜永辉 周雪源 李艳 赵玉

【摘要】卵母细胞质量与不孕、发育异常、囊胚数目的减少以及胚胎丢弃有关，而线粒体的功能是影响卵母细胞质量的重要因素，同时也是受精和获得健康后代的重要决定因素。越来越多的女性不孕症患者伴随着诸如糖尿病和肥胖等代谢疾病以及卵母细胞老化等问题，这类人群因为线粒体功能异常，在进行辅助生殖技术助孕的过程中往往也较难取得令人满意的妊娠结局。为了修复卵母细胞质量提高辅助生殖技术的成功率，核置换、极体移植等新技术引起了人们的重视。

【关键词】线粒体；卵母细胞；胚胎发育；新陈代谢；辅助生殖

Influences of mitochondrial functions on assisted reproductive technologyJIANG Yonghui1， ZHOU Xueyuan1， LI Yan1， ZHAO Yu2△. 1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， Shandong， China； 2. Department of Reproductive Medicine， The Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250001， Shandong， China

【Abstract】Quality-compromised oocytes are correlated with infertility， developmental disorders， reduced blastocyst cell number and embryo loss. Mitochondria are critical indicators of oocyte quality and are important for fertilization and development into viable offspring. Increasingly， women affected by metabolic disorders such as diabetes or obesity and oocyte aging are seeking treatment in assisted reproductive technology （ART）. However， these patients are difficult to obtain satisfactory outcomes. In order to restore oocyte quality and improve the success rate of ART， new technologies such as nuclear genome transfer and polar body genome transfer have caused peoples attention.

【Key words】Mitochondria； Oocytes； Embryo development； Metabolism； Assisted reproductive technology （ART）

【中图分类号】R711.6【文献标志码】A

生育已经成为一个世界性问题，线粒体功能异常与糖尿病、肥胖[1]及高龄妇女[2]的不孕情况有关。即使是在进行辅助生殖技术助孕过程中，这类妇女的妊娠结局也不够令人满意。

线粒体对卵母细胞功能的影响重大，其功能是评价卵母细胞质量的重要指标。线粒体的主要功能是产生ATP以提供能量。在已分化的体细胞中，ATP主要通过氧化磷酸化途径产生[3，4]；在大多数哺乳动物的卵母细胞中主要通过糖酵解途径和磷酸戊糖途径产生。ATP产生途径的变化主要与线粒体结构有关。胚胎形成阶段的线粒体结构从圆形（未成熟）转变为瘦长型（成熟、分化）时，线粒体代谢从主要的糖酵解途径转变成氧化磷酸化途径。和体细胞相比，我们对卵母细胞和提前移植胚胎的线粒体的了解相对较少，但是我们知道卵母细胞和胚胎线粒体的功能异常与不孕和胚胎发育异常有着重要的关系。

线粒体功能对减数分裂纺锤体的形成以及受精时MⅡ期的维持十分重要。ATP缺乏会导致非整倍体的发生，有研究指出，人卵母细胞染色体分离出错的比例大约是15%～20%[5]，5%是非整倍体的发生[6]。糖尿病和肥胖以及高龄妇女的卵母细胞发生非整倍体的频率更高。线粒体移植已经成功应用于一些质量受损的卵母细胞中[7]，但是这一新技术引起了广泛的伦理讨论的同时也带来了线粒体异质性和遗传疾病的风险[8]。本文将从线粒功能及对卵母细胞成熟、受精和胚胎发育的影响；线粒体功能异常；克服线粒体功能异常以提高试管婴儿成功率的机遇与挑战三个方面论述。

1线粒体功能及对卵母细胞成熟、受精和胚胎发育的影响

线粒体是多功能的细胞器，参与细胞能量产生、钙离子内环境平衡[9]、细胞信号传导、细胞凋亡[10]以及其它细胞活动[11]。在不同环境条件下，线粒体有巨大的潜能去调节它们的功能、动力以及新陈代谢活动。许多关于线粒体新陈代谢、动力、生物化学、分子组成和一些相关功能的研究已经在体细胞上证实，线粒体功能异常与人类神经系统疾病、心脏疾病、糖尿病和癌症等有关[12]。线粒体还是半自主的细胞器，人类mtDNA的长度为16，569bp，拥有37个基因，编码了2种rRNA（12S rRNA和16S rRNA）、22种tRNA（同样转运20种标准氨基酸，只是亮氨酸和丝氨酸都有两种对应的tRNA）以及13种多肽（呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的亚基）。线粒体活性除了主要依赖于线粒体整体的活力和动力外，还依赖于一些对细胞周期十分重要的功能和特性，如线粒体转换孔、膜电位、定位、分布模式和足够数量的mtDNA。线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）是存在于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体，是一种非特异性通道，其分子组成尚未完全清楚，多数学者认为是由外膜电压依赖的阴离子通道（VDAC）、内膜的腺嘌呤核苷转位蛋白（ANT）以及亲环素D等组成[13]。线粒体膜电位受线粒体活性影响，并且对卵母细胞的质量非常重要，相反，卵母细胞中低极性的线粒体会导致胚胎的发育异常[14]。

早期胚胎细胞的线粒体是圆形的，只有少数嵴，这一般作为功能未成熟线粒体和未分化细胞的特征。虽然现在还没有完全了解线粒体的功能机制，但是我们知道线粒体对于卵母细胞的成熟、受精和早期胚胎的发育很重要，并且为核膜分解、微管的组装和拆卸以及减数分裂和有丝分裂纺锤体的形成等活动提供ATP。

1.1卵母细胞的成熟

线粒体对卵母细胞的成熟十分重要，是卵母细胞在成熟过程中质量变化的可靠指标。初生女婴卵巢中的卵母细胞停留在GV期，在激素等促排卵因素的刺激下，生发泡破裂，第一极体（Pb1）排出，进入MⅡ期，成为成熟卵子。大多数哺乳动物的线粒体主要分布于纺锤体周围[15]。这种分布意味着线粒体对于纺锤体的形成以及维持纺锤体的完整性有重要意义。卵母细胞的重构过程需要线粒体提供ATP。线粒体提供的ATP对蛋白质的磷酸化和去磷酸化也十分重要，进而影响卵母细胞的成熟以及MⅠ期和MⅡ期纺锤体的形成[16，17]。

1.2受精

受精开始于MⅡ期，第二极体的排出是受精的标志，同时也是获得母亲单倍体遗传的标志。哺乳动物的胚胎中，精子的线粒体在受精的过程中被损坏了[18]，所以胚胎中的线粒体全部来自母亲[19]。MⅡ期卵母细胞包含胚泡期生长所需要的全部的足量的线粒体。线粒体分配不均导致人胚胎2-4细胞阶段线粒体遗传不均衡[20]，进而导致线粒体缺乏的卵裂球细胞溶解。发育中胚胎细胞的丢失会对胚胎的移植产生不良影响。

1.3早期胚胎发育

胚胎发育过程中需要的能量逐渐增加，此时线粒体特性的重塑就十分重要。胚胎早期发育时，线粒体会由一个简单的球形向更复杂的形态转变，包括发育更完全的嵴、密度更大的基质、瘦长或者枝状的形状。形态上的复杂变化与糖酵解到氧化磷酸化这样生物能量学转化有关，这一转化包括呼吸链复杂密度的增加和ATP的产生。细胞分化到滋养外胚层和内细胞团时线粒体的变化尤其明显[21]。Schatten[22]研究指出，线粒体的延长和增加的嵴的形成发生在滋养外胚层细胞分化成上皮层时，此时内细胞团细胞保持圆形，包含只有很少或没有嵴的线粒体。

许多关于成熟、受精、胚胎发育的研究已经在鼠、兔、牛、猪等动物身上试验过，但是关于人类的研究却很少。为了提高IVF成功率，这一领域的研究已在迅速发展。

2线粒体功能异常

卵母细胞成熟缺陷与ATP数量、钙稳态、激素效应等几个方面因素有关[23]。一些代谢性疾病如肥胖、糖尿病以及高龄等因素会降低卵母细胞质量。代谢异常不仅影响成年女性的卵母细胞质量，还会影响胚胎原始生殖细胞的功能[24]。线粒体对细胞质的成熟[25]（参与ATP合成）很重要，因此细胞质成熟过程中mtDNA复制数量的最低值意义重大。目前已有学者在鼠[26]、牛[27]、猪[28]以及人身上[29]进行相关研究。鼠、牛和猪的卵母细胞mtDNA复制数量个体间没有很大的差异。然而在人卵母细胞中，却有着20000～598000的显著的变化区间，平均为193000[29]，256000[30]，314000[31]。人卵母细胞中这一显著的区间变化可能反应了不同受验的IVF病人的差异[32]，这也意味着人卵母细胞质量变化与生殖问题有关。

线粒体功能异常对卵母细胞老化的影响包括以下几点：mtDNA复制数量的变化、突变负荷几率的增加、线粒体基因表达的变化、线粒体膜电位的降低、线粒体动力的改变、线粒体密度的增高、线粒体膜破裂的频率、ATP合成和代谢反应在电子传递链中的降低以及活性氧的增加[33]。活性氧产生于ATP生成的过程中，它可以导致mtDNA的氧化损伤进而导致突变和mtDNA数量的减少。由于mtDNA修复酶的数量很少，线粒体对氧化应激诱导的损伤十分敏感[34]。mtDNA突变率是核DNA突变率的10～20倍[35]，这可能与有限的DNA修复能力有关。mtDNA突变负荷的积累反向影响线粒体功能进而对早期胚胎发育产生不良影响。

糖尿病和肥胖已经成为了引起全世界关注的问题，据估计全世界大约有15亿人和10亿人受糖尿病和肥胖问题干扰。糖尿病和肥胖是导致线粒体功能异常的两个主要诱因，这大大增加了辅助生殖技术中糖尿病和肥胖患者的人数。

3克服线粒体功能异常以提高IVF成功率的机遇与挑战

提高IVF成功率最具有挑战性的难点是如何提高糖尿病、肥胖、高龄以及其它代谢异常女性卵母细胞线粒体的质量。细胞质转移，即受体卵母细胞接受含有健康线粒体的供体卵母细胞的置换，已经被认为是消除线粒体突变的优选治疗方式[36]。许多发育异常疾病与线粒体功能异常相关的研究近年来有较大进展，比如神经系统疾病、糖尿病、癌症、免疫系统以及一些影响世界大部分人的疾病[37]。由于核基因组上线粒体的功能依赖性，用于供体转移的细胞类型需要特别考虑。生殖系优质线粒体最好可以从卵母细胞前体细胞中获得，优先使用以减少可能损害氧化磷酸化作用[38]。这可能会出现线粒体异质性，但是在体细胞核移植（SCNT）上的研究证实其在一定程度上可以接受[39]。正常妇女出现线粒体异质性的几率是3%[40]，目前并没有在这些人身上发现不良影响。通过细胞质转移来增加健康线粒体的数量不仅有利于母亲克服生育问题，也有利于受母亲影响的孩子避免遗传缺陷的线粒体。在许多情况下，小数量的线粒体转移足以恢复最佳线粒体功能并防止次优线粒体遗传给下一代。

除了细胞质转移，补充辅酶Q10增加线粒体活性，也被认为是提高质量受损的卵母细胞线粒体功能的一个途径[41]。线粒体呼吸链电子转移过程中的辅酶Q10助剂是能量产生过程中的一个关键酶。其它治疗方法还包括线粒体靶向药物的研究[12]等。消除mtDNA突变遗传给后代的可行性方法是选取不同女性的两个卵母细胞。

3.1纺锤体-染色体复合物移植[36]

在GV期或者MII纺锤体期，将患者卵子的核转移到含有健康线粒体的去核供卵中。重组后的卵包含了供体的mtDNA、患者的核DNA，以及少量的随核一起转移过来的患者mtDNA。然后把通过卵泡浆内单精子注射技术获得的胚胎移植到患者子宫里。这一过程也叫做“三亲试管婴儿”，但是其核基因主要来自于父母。

3.2原核移植

含有异常线粒体的患者的卵受精后，把其原核取出并转移到去除原核的拥有正常线粒体的受精卵中。重组后的受精卵在体外培养到一定阶段后再移植到患者子宫中。原核移植过程中仍然会有少量患者的mtDNA随原核一起转移。

3.3极体移植[42]

前两种方法都无法彻底替换掉不正常的线粒体，最新的研究发现，极体中线粒体含量极少并且拥有与核一样的遗传物质，故有望成为线粒体捐赠的首选核供体。基于此，首先移除供卵MⅡ期纺锤体使其无核化，然后患者卵子受精后取出第二极体并移植到无核的供体卵母细胞中。此时供体卵母细胞包含着患者的核DNA和健康的线粒体，接下来通过常规IVF获得妊娠。

线粒体置换能够有效的解决线粒体遗传病问题和辅助生殖低成功率的问题，然后这一新技术的广泛应用仍然面临着许多伦理问题。早在2011年，英国人类受精与胚胎管理局（human fertilisation and embryology authority，HFEA）便已着手总结当年线粒体置换调研结果[43]。2014年6月，经过漫长的科学和伦理评估以及公共咨询之后，英国公布了新的草案，拟允许HFEA批准医院进行线粒体置换的临床研究[44]。2015年2月份英国下议院通过了mtDNA替代疗法新技术的决议，若继续通过上议院的投票，世界上首个“三亲婴儿”将有望在2016年出生。

4前景与展望

过去十年见证了质量缺陷卵母细胞潜在治疗的巨大希望，这一领域的研究对肥胖、糖尿病、高龄等代谢障碍的妇女意义重大。膳食补充辅酶Q10、线粒体移植等将为卵母细胞质量缺陷的妇女提高IVF成功率和实施新的治疗方法提供了希望。通过对线粒体不断的探索和研究，相信mtDNA必然可以在辅助生殖技术中发挥更重要的作用，造福于患者及其家庭，使人类的生殖医学水平迈进一大步。

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