心脑宁片对大鼠脑缺血模型凋亡基因Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

马珍珍，谢国旗，郝少君，张正臣，刘　艳

心脑宁片对大鼠脑缺血模型凋亡基因Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

马珍珍，谢国旗，郝少君，张正臣，刘艳＊

目的研究心脑宁片对大鼠脑缺血模型脑组织匀浆中凋亡基因Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。方法取体重180～200 g雄性Wistar大鼠36只，随机分为3组：第一组为假手术组，其余2组造脑缺血模型。模型Ⅰ、Ⅱ组分别灌服0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）和同体积的0.75 g/kg含量的心脑宁片混悬液，采取酶联免疫技术测定匀浆中Bcl-2及Bax的含量。结果与假手术组比较，模型Ⅰ组大鼠脑组织匀浆中Bcl-2含量显著增加（P＜0.05），而Bax含量非常显著增加（P＜0.01）；与模型Ⅰ组比较，模型Ⅱ组有显著高的Bcl-2含量（P＜0.05）和显著低的Bax含量（P＜0.05），且Bcl-2/Bax显著升高（P＜0.05）。结论心脑宁片可以提高抑凋亡基因含量，降低促凋亡基因含量，明显增加抑凋亡基因与促凋亡基因的浓度比率，表明其对脑组织有着明显的保护作用。

心脑宁片；大鼠；脑缺血；Bcl-2；Bax；Bcl-2/Bax

DOI:10.14172/j.issn1671-4008.2016.10.019

心脑宁片是根据中医理论和现代药理研究成果拟定的院内协定处方［1］。心脑宁片由人参、当归及川芎等组成。制作方法：各取120 g人参、黄芪，粉成100目细粉备用。剩余部分人参、黄芪及其他组成药均被粉碎成10目粗粉，加水（8倍）煎煮二次，均为2 h，之后合并煎液，过滤，80℃浓缩滤液（相对密度1.15～1.30）。加入备好的细粉，取淀粉适量，混匀，干燥成干膏，粉碎，经14～16目筛制粒，烘干，用14目筛整粒，加入1%硬脂酸镁混匀，压片（每片0.3 g），包衣，制成1000片即得（每片相当含生药1.75 g）。该制剂具有活血化瘀，益气安神，用于冠心病，脑血栓形成等，亦可用于记忆力减退，抗衰老等作用，有满意的临床效果［1-3］。

为了进一步探究其疗效原理，笔者对灌服心脑宁片的大鼠脑缺血模型脑组织匀浆液中凋亡相关基因Bcl-2、Bax等含量做了测定，旨在为进一步解释心脑宁片治疗心脑血管等疾病的疗效提供理论基础。

1　材料与方法

1.1实验药品心脑宁片由解放军第371医院制剂室提供，批号20110606；羧甲基纤维素钠（Sodium salt of Caboxy Methyl Cellulose，CMC），天津恒兴化学试剂制造有限公司，批号20090723；生理盐水，河南华利制药股份有限公司生产，批号11041806；大鼠凋亡相关因子（BCL-2）ELISA试剂盒，上海研谨生物科技有限公司，产品货号：F01425；大鼠Bcl-2相关蛋白X（Bax）ELISA试剂盒，上海丰寿实业有限公司，产品货号：EIA-01319。

1.2实验动物清洁级，Wistar大鼠，河北省动物实验中心提供，合格证号1112028。

1.3实验仪器FA（N）/JA（N）系列电子天平，由上海民桥精密仪器有限公司生产；TGL-16G高速冷冻离心机，由上海安亭科学仪器厂生产；DZKW-4型电子恒温水浴锅，由北京市永光明医疗仪器厂生产；微量加样器（规格：2～20 μl、5～50 μl、10～100 μl、20～200 μl和100～1000 μl），由美国Thermo Electron生产；Thermo酶标仪（上海热电仪器有限公司）。

1.4实验方法取体质量180～200 g Wistar大鼠36只，雄性。随机分为3组：假手术组及造脑缺血模型（模型Ⅰ、Ⅱ组）。模型Ⅱ组灌服0.75 g/kg含量的心脑宁片混悬液 （用0.5%CMC配成37.5 mg/ml，为临床用量的10倍，2 ml/100 g）、模型Ⅰ组灌服同体积的0.5%CMC，假手术组灌同体积的0.5%CMC；给药1次/d，连续给药7 d，于第6天晚上8点禁食不禁水，第7天上午给药后1 h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，然后做颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，动脉下各置一手术线，结扎血管；假手术组只麻醉解剖不结扎双侧颈总动脉。各组动物结扎后挂线60 min（假手术组除外）后，断头取脑，取一半加9倍量生理盐水，用匀浆机制成10%脑匀浆，分别采用酶联免疫技术测定脑匀浆中Bcl-2、Bax的含量。测定方法按试剂盒说明书进行。根据本课题组前期报道，大鼠脑缺血模型造模成功［4］。

1.5统计学方法数据分析用SPSS 13.0 for Windows统计软件包进行数据资料的统计学处理，计量资料用平均数±标准差（±s）表示，组间比较用方差分析（LSD法）。

2　结果

2.1心脑宁片对大鼠脑缺血模型脑组织匀浆中Bcl-2含量的影响与假手术组比较，模型Ⅰ组大鼠脑组织匀浆中Bcl-2含量增加，但差异不显著（P＞0.05）；与模型Ⅰ组比较，模型Ⅱ组大鼠脑组织匀浆中Bcl-2含量显著增加（P＜0.05）。见表1。

2.2心脑宁片对大鼠脑缺血模型脑组织匀浆中Bax含量的影响与假手术组比较，模型Ⅰ组大鼠脑组织匀浆中Bax含量极显著增加（P＜0.01）；与模型Ⅰ组比较，模型Ⅱ组大鼠脑组织匀浆中Bax含量显著降低（P＜0.05）。见表1。

2.3心脑宁片对大鼠脑缺血模型脑组织匀浆中Bcl-2/Bax的影响与假手术组比较，模型Ⅰ组大鼠脑组织匀浆中Bcl-2/Bax显著降低 （P＜0.05）；与模型Ⅰ组比较，模型Ⅱ组大鼠脑组织匀浆中Bcl-2/ Bax显著升高（P＜0.05）。见表1。

表 1　心脑宁片对大鼠脑缺血模型脑组织匀浆中Bcl-2、Bax含量的影响（±s）

表 1　心脑宁片对大鼠脑缺血模型脑组织匀浆中Bcl-2、Bax含量的影响（±s）

注：与假手术组比较，＊P＜0.05，△P＜0.01；与模型Ⅰ组比较，#P＜0.05。

组别　　动物数（只）　　剂量（g/kg）　Bcl-2（pg/ml）　Bax（pg/ml）　Bcl-2/Bax假手术组　12　111.03±21.10　231.09±36.71　0.48±0.16模型Ⅰ组　12　126.89±23.63　483.21±43.19△　0.26±0.09＊模型Ⅱ组　12　0.75　187.72±38.08#　372.40±44.35#　0.50±0.12#

3　讨论

Bcl-2家族蛋白的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一，并且在细胞凋亡信号转导通路中发挥着重要的作用［5］。Bcl-2被认为是细胞凋亡蛋白家族中最重要的调控蛋白，Bcl-2的功能受其蛋白产物Bax和Bcl-xl的调节［6］。已知Bcl-2不像其他典型的癌蛋白那样破坏细胞正常的增殖调控机制，而是通过阻止凋亡而促进细胞存活。Bax能允许一些离子和小分子如细胞色素C等穿过线粒体膜，进入细胞质，从而引起细胞凋亡，而Bcl-2的作用正好相反，它能封闭Bax形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，从而保护细胞凋亡［7］。细胞凋亡的发生取决于促凋亡成员和抑凋亡成员的相对浓度，因而，Bcl-2家族成员的构成比例形成了细胞凋亡的“分子开关”。Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；Bax与Bcl-2形成异源二聚体时则实现了Bcl-2抑制细胞凋亡的功能［8］。Bcl-2与Bax蛋白量的比率决定异二聚体（Bcl-2/Bax）与同二聚体（Bax/Bax）的比值，这对决定细胞凋亡的易感性起关键作用。一般而言，Bcl-2的过度表达与Bax形成异二聚体而阻抑凋亡。

研究表明，针刺能促进脑缺血后大鼠抗细胞凋亡基因Bcl-2蛋白的表达，抑制促细胞凋亡基因Bax蛋白的表达，增大Bcl-2/Bax比值，达到抗细胞凋亡的作用［9］。与假手术组比较，脑缺血模型组Bcl-2表达下降、Bax表达上升、Bcl-2/Bax比值下降；经肌肽处理后Bcl-2表达上升、Bax表达下降，Bcl-2/Bax比值上升，表明这可能是肌肽发挥神经保护作用的分子机制之一［10］。与脑缺血模型组比较，失荅剌治丸组大鼠脑组织匀浆中Bcl-2表达增加、Bax表达降低，同时凋亡细胞数明显减少，表明失荅剌知丸对脑可起到保护作用［11］。井穴放血与安宫牛黄丸结合在脑缺血早期能使Bcl-2增多、Bax减少，能有效抑制永久性大脑中动脉闭塞大鼠脑细胞凋亡，发挥脑保护作用［12］。与假手术组相比，缺氧缺血组在2 h、12 h、24 h、48 h、72 h脑组织中Bcl-2、Bax的表达均增加，与缺氧缺血组相比，氨基甲酰化促红细胞生成素 （CEPO）干预组在不同时间点Bcl-2表达增加，Bax表达下降［13］。银杏达莫可提高Bcl-2表达、抑制Bax表达，进一步对局灶缺血性脑损伤起到预防性保护作用［14］。

心脑宁片主要由活血药和补气药组成。吕宏迪等报道心脑宁片均可显著降低脑匀浆LD水平，升高脑匀浆LDH活力，并可显著升高脑匀浆ATP酶的活力，说明心脑宁片具有明显改善脑缺血作用［4］。马珍珍等认为心脑宁片有显著改善脑组织形态的作用［15］。本实验结果显示，与假手术组比较，模型Ⅰ组大鼠抗凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bax含量均增加，但Bax含量增加大于Bcl-2，导致Bcl-2/Bax显著降低，对大鼠脑细胞起到了促凋亡作用；与模型Ⅰ组比较，模型Ⅱ组大鼠脑组织匀浆中Bcl-2含量显著增加，Bax含量明显下降，Bcl-2/Bax显著升高，表明心脑宁片对脑缺血大鼠脑组织起着明显的保护作用。

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［2016-02-12收稿，2016-03-10修回］［本文编辑：韩仲琪］

Effect of Xinnaoning tablets on the Bcl-2，Bax levels of the cerebral ischemia model rat

MA Zhenzhen①，XIE Guo-qi，HAO Shao-jun，et al.①Dept.of Bone，the 371st Central Hospital of PLA，Xinxiang，Henan 453000，China

ObjectiveTo study the effect of Xinnaoning tablets on the Bcl-2，Bax levels of the rat cerebral ischemia model.MethodsThirty-six male Wistar rats were divided into three groups.The first group was the sham operation group，and the other two groups were made into the cerebral ischemia model，i.e model groupⅠ was fed with CMC suspension and model groupⅡ was fed with 0.75 g/kg suspension of this tablets，and then the Bcl-2，Bax levels in three groups were detected by ELASA.ResultsCompared with the sham operation group，model groupⅠ had the higher Bcl-2 level（P＜0.05），and significantly higher Bax level（P＜0.01）；Compared with the model groupⅠ，model groupⅡ had significantly higher Bcl-2 level and Bcl-2/Bax（P＜0.05），but lower Bax level（P＜0.05）.ConclusionXinnaoning tablets could have a protective effect on the brain tissue，which showedbyitupliftingthelevelofsuppression-apoptosisgene，decreasingpromotion-apoptosisgene，and significantly in creasing the ration of both.

Xinnaoning tablets；Rat；Cerebral ischemia；Bcl-2；Bax；Bcl-2/Bax

R743

A

453000河南新乡，解放军371医院（马珍珍，谢国旗，郝少君，张正臣，刘艳）

刘艳，Email：184969914@qq.com