根霉脂肪酶选择性水解红花油富集亚油酸

甘争艳 ，付青存，贾殿赠

(1.新疆轻工职业技术学院,新疆 乌鲁木齐 830021；2.新疆大学研究生院,新疆 乌鲁木齐 830046)



精细化工与催化

根霉脂肪酶选择性水解红花油富集亚油酸

甘争艳1*，付青存1，贾殿赠2

(1.新疆轻工职业技术学院,新疆 乌鲁木齐 830021；2.新疆大学研究生院,新疆 乌鲁木齐 830046)

通过实验探讨温度对根霉脂肪酶选择性水解红花油的影响，并进行条件优化。在pH=6.0的K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液中,水解温度30 ℃、根霉脂肪酶用量为红花油质量的2%、水油质量比为1和添加剂CaCl2用量为红花油质量的0.2%条件下，红花油水解率为66.5%，可富集浓度96.2%的亚油酸。

精细化学工程；根霉脂肪酶；富集；亚油酸

亚油酸是含有两个双键的多不饱和高级脂肪酸，工业生产中应用广泛；亚油酸能降低血液胆固醇，预防动脉粥样硬化，在医疗中得到重视[1]。亚油酸不能由人体合成，是公认的惟一的必需脂肪酸[2]，其在红花油中含量远高于其他植物。常规富集亚油酸是将红花油经皂化和酸化后，再用尿素包合，进行蒸馏获得亚油酸，这种方法容易造成亚油酸双键破坏。与皂化法相比，脂肪酶可在常温下催化红花油水解，从而避免对亚油酸中双键的破坏。在缓冲溶液中用酶催化油脂水解，避免了有机溶剂的毒性，且后期分离比较容易[3]。根霉脂肪酶Lipase F-AP15水解油脂时，优先水解α位的酯键，而红花油中亚油酸酯键大多位于α位，在控制合适水解率时，可以富集高浓度亚油酸。 本文探讨温度对根霉脂肪酶选择性水解红花油的影响，并研究水解红花油富集亚油酸的优化工艺条件。

1　实验部分

1.1试剂与仪器

根霉脂肪酶Lipase F-AP15，日本天野公司，酶活力150 000 U·g-1；红花油，伊犁，碘值146.1 mg·g-1，红花油中亚油酸含量79.2%；氢氧化钠标准溶液为0.1 mol·L-1和0.5 mol·L-1；10 g·L-1酚酞指示剂；磷酸二氢钾；磷酸氢二钾；石油醚；正己烷；去离子水；乙醚；氯仿。

ZD-8802型振荡器；Orion 828型酸度计，美国奥立龙公司；高速组织捣碎机；微量注射器。

1.2水解方法及水解率的计算

在A组锥形瓶中加入红花油，B组锥形瓶中加入按一定比例配制的酶/水(或缓冲液)溶液，预热到水解温度后按实验设计将两组溶液迅速混合，并放入振荡器，以设定速率振荡到预定时间后，迅速加入无水乙醇终止水解，并用氢氧化钾标准溶液滴定，计算混合体系酸值。红花油水解率通过下式计算：

式中，AVt为反应结束时水解产物酸值，AV0为反应开始时体系酸值，SV为红花油皂化值，AV为红花油酸值。红花油皂化值SV可取平均值193 mg·g-1,酸值为1.5 mg·g-1。

2　结果与讨论

2.1水解温度

在根霉脂肪酶用量为红花油质量的2%、水油质量比为1、pH=6.0的K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液和振荡器震荡速率200 r·min-1条件下，考察水解温度对根霉脂肪酶选择性水解红花油的影响，结果见图1。

图 1　水解温度对红花油水解率的影响Figure 1　Influence of hydrolysis temperatures on hydrolysis ratios of safflower oil

由图1可见，水解时间大于60 min时，40 ℃时可获得较大水解率。水解时间10 min时，水解率随水解温度上升而增加，水解温度超过50 ℃时，水解率下降。主要是因为：(1) 随着水解温度升高，活化分子数增多，水解反应速率加快；(2) 由于水解温度升高，酶失活加速，导致水解速率下降。水解时间短时，酶变性失活不明显，温度升高导致的水解速率增加占优势，而长时间水解时，酶变性失活更为显著[4]。水解时间1 440 min，水解温度20 ℃，水解率为67.7%，与理论水解率66.67%接近，反应温度35 ℃、40 ℃和45 ℃时，水解率分别为81.4%、83.2%和80.6%，明显超过66.67%，分析原因可能是：已部分水解的产物2-单甘酯和1，2-二甘酯在较高温度下经历较长时间发生酯键重排，2位上的酯键重排至1、3位。酯键重排后，可以继续被脂肪酶水解，导致水解率升高；水解温度越高，酯键重排比例越大，酶催化位置选择性下降。

水解温度超过50 ℃，并进行较长时间水解时，水解率不升反降。分析原因：根霉脂肪酶是一种具催化活性的蛋白质，在超过了根霉脂肪酶的最高催化温度时，酶变性失活，水解速率下降，且温度越高，酶失活速率越快。分析可知，在较低温度下水解，重排反应少,根霉脂肪酶选择性水解率高，有利于获取高浓度的亚油酸；但温度过低时，水解速率过低，导致反应时间过长，综合分析以上因素，水解温度选择30 ℃较为合适。

2.2pH值

在根霉脂肪酶用量为红花油质量的2%、水油质量比为1、水解温度30 ℃、水解时间120 min、振荡器震荡速率200 r·min-1和0.05 mol·L-1的K2HPO4/KH2PO4为缓冲溶液条件下，考察缓冲溶液pH值对红花油水解率的影响，结果见图2。

图 2　缓冲溶液pH值对红花油水解率的影响Figure 2　Influence of buffer solution pH values on hydrolysis ratios of safflower oil

由图2可见，pH=6.0时，水解率较高，表明脂肪酶在此微酸性条件下活力较高。

2.3脂肪酶用量

在水油质量比为1、水解温度30 ℃，pH=6.0的K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液0.05 mol ·L-1和振荡器震荡速率200 r·min-1条件下,考察不同根霉脂肪酶用量时，水解时间对红花油水解率的影响，结果见图3。

图 3　不同根霉脂肪酶用量时，水解时间对红花油水解率的影响Figure 3　Influence of hydrolysis time on hydrolysis ratios of safflower oil over F-AP15 lipase with different enzyme levels

由图3可见，水解初期，水解率随水解时间增长较快；水解时间超过960 min，水解率随时间延长增长速度缓慢，这是因为根霉脂肪酶催化红花油水解时，具有位置选择性，因此，不宜采用过长的水解时间。红花油中的亚油酸主要位于α位，将水解率控制在理论水解率66.7%时，富集亚油酸的效果最佳。实验结果表明，根霉脂肪酶用量为红花油质量的1%和水解时间960 min时，水解率为65.3%，接近理论值，水解时间1 440 min时，水解率为68.9%；根霉脂肪酶用量为红花油质量的2%和水解时间480 min时，水解率为66.5%，接近理论水解率。综合考虑脂肪酶成本及水解时间，根霉脂肪酶用量为红花油质量的2%较合适。

2.4亚油酸的富集

所选实验条件为：根霉脂肪酶用量为红花油质量的2%，水油质量比为1，CaCl2用量为红花油质量

的0.2%，水解温度30 ℃，K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液pH=6.0，振荡器振荡速率200 r·min-1,水解时间480 min,此条件下，红花油水解率为66.5%。对水解后高级脂肪酸混合物进行薄层色谱分析，亚油酸含量达96.2%。

3　结　论

(1) 采用根霉脂肪酶水解红花油富集亚油酸，条件温和，在根霉脂肪酶用量为红花油质量的2%、CaCl2用量为红花油质量的0.2%、水解温度30℃和，K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液pH=6.0条件下，水解率为66.5%，水解后可获得含亚油酸高达96.2%的脂肪酸混合物。

(2) 该法具有操作简单、条件温和及产品质量好等特点，为富集亚油酸提供了一种经济可行的方法。

[1]刘庆文.脂肪酶催化拆分四氢苯并咪唑-5-羧酸酯及其应用研究[D].吉林：吉林大学，2011. Liu Qingwen.Study on the lipase-catalyzed resolution of tetrahydro-1H-benzoimidazole-5-carboxylate and its applications[D].Jilin:Jilin University,2011.

[2]张开平,惠明,田青,等.微生物脂肪酶的应用领域及研究进展[J].河南工业大学学报:自然科学版,2012,33(1):90-94.

Zhang Kaiping,Hui Ming,Tian Qing,et al.research progress and application fields of microbial lipase[J].Journal of Henan University of Technology(Natural Science Edition),2012,33(1):90-94.

[3]I-Son Ng,Shau-Wei Tsai.Inverstigation of lipases from various carica papaya varieties for hydrolysis of olive oil and kinetic resolution of (R,S)-profern 2,2,2-trifluoroethyl thioesters[J].Process Biochemistry,2006,41(3):540-546.

[4]甘争艳.无溶剂及微乳液体系中脂肪酶催化油脂水解反应研究[D].乌鲁木齐：新疆大学,2006.Gan Zhengyan.Enzymatic oil hydrolysis in solvent-free medium and micro-emulsion medium[D].Urumqi：Xinjiang University，2006.

Selective hydrolysis of safflower oil by rhizopus lipase to enrichment of linoleic acid

GanZhengyan1*,FuQingcun1,JiaDianzeng2

(1.Xinjiang Vocational College of Light Industry,Urumqi 830021，Xinjiang，China；2.Graduate School of Xinjiang University，Urumqi 830046，Xinjiang，China)

The effects of temperature on selective hydrolysis of safflower oil by rhizopus lipase were investigated,and the conditions were optimized.The experimental results showed that the hydrolysis rate of safflower oil was 66.5% and the concentration of linoleic acid was 96.2% in the hydrolysis product under the optimum condition as follows:hydrolysis temperature 30 ℃,K2HPO4/KH2PO4buffer solution pH=6.0,enzyme dosage 2% of safflower oil mass,water/oil mass ratio 1,and additive CaCl2dosage 0.2% of safflower oil mass.

fine chemical engineering；rhizopus lipase;enrichment;linoleic acid

TQ426.97；Q55Document code: AArticle ID: 1008-1143(2016)09-0075-03

2016-06-06

甘争艳，1971年生，女，硕士，工程师，研究方向为催化反应。

甘争艳。

10.3969/j.issn.1008-1143.2016.09.016

TQ426.97；Q55

A

1008-1143(2016)09-0075-03

doi:10.3969/j.issn.1008-1143.2016.09.016