腐殖质结构与活性关系研究

A. Muscolo， M. Sidari， S. Nardi著路艳艳吴钦泉洪丕征陈士更丁方军，5*译

（1 意大利雷焦卡拉布里亚地中海大学林业系 雷焦卡拉布里亚 89060 2 意大利帕多瓦大学农业生物技术系 帕多瓦 35020 3 山东农大肥业科技有限公司 泰安 271000 4 山东省腐植酸高效利用工程技术研究中心 泰安 271000 5 山东农业大学资源与环境学院 泰安 271018）

腐殖质结构与活性关系研究

A. Muscolo1， M. Sidari1， S. Nardi2著路艳艳3，4吴钦泉3，4洪丕征3，4陈士更3，4丁方军3，4，5*译

（1 意大利雷焦卡拉布里亚地中海大学林业系 雷焦卡拉布里亚 89060 2 意大利帕多瓦大学农业生物技术系 帕多瓦 35020 3 山东农大肥业科技有限公司 泰安 271000 4 山东省腐植酸高效利用工程技术研究中心 泰安 271000 5 山东农业大学资源与环境学院 泰安 271018）

腐殖质（HS）的复杂性以及其在农业生产中的重要作用，使有关HS的研究越来越受到科研人员的关注，多年来，带来了其在物理化学、生物学及结构性能等方面的新知识。然而，由于HS结构与活性的关系难以确定，学者们对二者间的关系仍存在较大争议。本研究表明，HS对植物生长的影响取决于HS级分的来源、浓度、分子量等，以及包含其中的不同化合物。HS也显示了类激素活性，特别是类生长素活性。目前，这种类生长素活性是完全与HS的化学结构相关，还是取决于微生物来源的激素，例如其中的吲哚乙酸（IAA），还不清楚。总之，HS对植物细胞生长和发育是具有刺激作用的。我们将在本研究中对HS结构、化学组成与其对植物生长和代谢的生理效应间的关系进行讨论，尤其是描述植物对HS的应答以及允许植物应对HS的调节回路。此外，就目前的结果如何增加HS新的信息是广泛讨论的问题。

植物生长素 生物效应 愈伤组织生长 化学组成 腐殖质 根系生长

腐殖质（HS）是复杂的、不均一的多分散材料混合物，是由植物和微生物残骸在腐烂和转化过程中通过生物、化学等反应生成的（称为腐殖化过程）。植物木质素及其转化的物质、多糖、黑色素、角质、蛋白质、脂质、核酸、细炭颗粒等是腐殖化过程的重要组分。HS具有很高的化学活性，且不易被生物降解。大部分数据指出，HS是由不同结构和分子量组分组成的聚合体。一个给定HS样品的结构和功能取决于水或土壤资源、植被及提取的具体条件。

在过去200年间，学者对于“HS”这个物质是一直存在科学争议的，它是非常复杂的胶状超级混合物，从未被分离成纯组分。传统意义上，HS是根据分子量及在不同pH水溶液中的溶解度来区分的，提取工艺上的微小差异可能导致提取物中活性组分的不同。HS是一种类聚合体分子。由HS形成的围绕不溶性矿物的双层膜可使人联想到生命体利用生化反应的方式。许多学者认为自组织（胶束）胶体阶段就像细胞系统中的生物分子，具有非常相似的活性膜生物机制。pH的微小变化可导致HS聚合物断裂为原始分子，这些断裂的分子可以与其他自由基、重金属和杂质自由结合。HS由数百种不同大小的分子（多分散性）通过扭曲、弯曲、压缩、扩展等诸多不同的方式组合而成，在弱作用力下以较松弛的胶体状态存在。溶液pH、浓度、金属离子（特别是钙离子）的存在会引起HS分子结构的巨大改变。甚至轻微的改变会引起分子的数量级次序改变。对于HS来说，其分子结构的快速改变并不是唯一的，例如水分子，一秒钟结构改变10万亿次。尽管水是一种极简单的分子，但是水分子在任何瞬间的结构并不完全确定。早期的概念形成于聚合物科学的发展领域，例如Piccolo认为HS是由随机盘绕的大分子组成，这些大分子在碱性或低离子强度溶液中可延伸，但在酸性或高离子强度溶液中会变得卷曲。Swift支持这种HS“聚合物模型”，认为HS中分子的加权平均分子量为20000～50000 Da。然而，近期使用光谱、显微镜、热解和软电离技术的研究结果与HS“聚合物模型”并不一致。对致力于HS形成和保存土壤过程的最新调查也对“聚合物模型”产生了质疑。

因此，有些学者为HS提出了新定义，认为HS是由许多相对较小和化学多样性的有机分子通过氢键和疏水作用形成超分子联合体。这个模型的一个推论是胶束结构的概念，即在水溶液中的有机分子形成亲水表面区域来屏蔽疏水的内部与附近水分子的接触。这些新模型强调的是分子间的相互作用，按惯例来讲，传统上通过去除密切相关的生物分子来纯化HS，尝试不成功很大程度上可能是被误导的，而对传统概念的经验性替代可能更有意义。这个替代概念认为所有分子与HS级分密切相关，包括必须通过化学性质的重大改变才能去除的可识别生物分子。此外，HS级分中的酰胺态氮的普遍存在也暗示“聚合物模型”在自然系统中并不占主导作用。事实上，在“聚合物模型”中假定的关键合成反应并不包括在HS形成中起作用的酰胺态氮官能团。陆地上HS结构的多样性可归因于生态系统资源利用模式的差异以及不同的外部干扰。

HS的高度复杂性的成因可能永远不会被揭开，但是其显著的功能会持续吸引科研人员去研究其结构、物理化学及生物特性，以便这种天然复合物能在更多的生产实践中得到应用。

到目前为止，许多关于HS生物效应的调查是有争议的，这主要是由于缺乏对HS组成的详细了解造成的，因而很难确定HS结构组成与其活性之间的关系。

本研究目的在于综述HS对植物影响的最新进展，特别是对其在植物中的转化机制研究，及如何将最新的科研成果应用于分析其结构和活性关系之中。

1　植物生理和代谢

研究认为HS对植物生长的影响主要取决于HS级分的来源、浓度、分子量等。

许多学者通过大量工作来确定HS中化合物的主要结构，或者分子量影响植物的生长发育。为此，有关HS处理下的植物生长、发育以及结构的研究正日益增多。

Malcom，Mato和Pflug等的研究表明，羧基和羟基官能团可能在决定HS活性方面起着主要作用，但是这2种官能团是如何起作用的仍需进一步研究。同时，HS的低分子量（LMW）组分异常活跃，高分子量（HMW）组分具有残余活力，反映了HS分子量的生物学活性。Visser研究发现，HS的LMW级分和黄腐酸（FA）具有较高的与金属结合的能力，与HMW级分相比，因其具有较多的官能团（特别是羧基和酚基），在改善植物营养吸收和新陈代谢中发挥作用。LMW级分的有效性是分子量低和富含芳香基、羧基和酚基的结果。

Muscolo等通过研究证实了以上观点：HS级分对胡萝卜细胞培养的调控性能取决于高酸度（特别是羧基）与LMW的结合（表1）。与生长素处理组和对照组相比，HS的LMW级分能显著促进胡萝卜细胞的生长和代谢活动。Nardi等的研究表明，HS的LMW级分（具有高酸度、肽基和羰基碳基团）显著促进了玉米幼苗对硝酸盐的吸收，并且强烈地抑制了玉米微粒体中K+-ATP酶和H+的分泌（表2）。此外，他还发现羧基、芳香碳含量高的HS的LMW级分和肽基、羰基碳基团含量高的HS的HMW级分对松属2个树种的代谢参数均产生了显著的正效应，这种现象表明，可能是化学组成而非分子量是这2个HS级分产生生理活性的原因（表3）。

表1　不同处理下胡萝卜细胞生长、蛋白质含量、谷氨酰氨合成酶（GS）、谷氨酸脱氢酶（GDH）和苹果酸脱氢酶（MDH）活性Tab.1 Cell growth， protein content， glutamine synthetase （GS）， glutamate dehydrogenase （GDH） and malate dehydrogenase （MDH） activities in carrot cells with different treatments

表2　HS的LMW级分处理对玉米幼苗鲜重、NO3-和K+吸收的影响Tab.2 A low molecular weight humic fraction （LMW） was tested on fresh weight， nitrate uptake and K+uptake in maize seedlings

表3　HS的LMW和HMW级分对樟子松幼苗根系的转化酶、过氧物酶、酯酶活性的影响Tab.3 Effect of humic fractions with LMW and HMW on invertase， peroxidase and esterase activities in Pinus sylvestris seedling roots

已有许多学者做出如下假设：HS可能被植物根系吸附，即使HMW和LMW级分的行为似乎有所不同。这一假设与Nardi等的研究结果基本一致。其中Nardi等研究发现，HMW和LMW处理均提高了植物根系分化的速率，但HMW处理对植物根系分化的速率提高表现尤为显著（图1），它同时刺激了与植物生长和分化相关酶的活性。在Sessi等的研究中表明，HS的LMW级分极大地促进了植物对NO3-的吸收，而HMW物质却延缓了植物对NO3-的吸收速率。以上所有的不确定性使得许多学者基于分子大小来分离纯化HS，以简化对HS生物活性的研究。

Nardi等通过将腐植酸（HA）分离为3个分子量递减的级分来研究其结构与生物活性的关系。结果表明，具有最少刚性分子构象的最小分子量级分，木质素部分含量最低，其他非木质素芳香族化合物含量最大具有最强的生物效应。所有这些结果可能归因于HS可变的构象结构，这种结构可促进具有生物活性的HS组分在玉米细胞中更为有效地扩散。他的结果还表明，整体HA及其3个级分通过不同的方式影响了与糖酵解和三羧酸循环（TCA）相关酶的活性，而方式的不同取决于其分子大小、分子特性和浓度。

为了弄清HS的生物活性与其分子量和化学结构的相关性，Muscolo等测定了2种从未经耕作的毛草地和森林土壤中提取的HS，即在欧洲黑松阿诺德愈伤组织上分离出的低分子量（＜3500 Da）HS和高分子量（＞3500 Da）HS。用H核磁共振谱和漫反射红外光谱对这2种HS进行研究，结果表明，两者之间差异较为显著。在草地HS级分中检测到大量脂肪类和糖类组分以及β-CH3部分，在森林HS级分中检测到高含量甜菜碱、有机酸和COOH官能团。同时，对草地和森林HS级分的生物活性也进行了观测（表4）。结果表明，这2种HS的不同生物活性可能与多种化学组分有关，而与不同的分子量无关。

表4　生长素及森林或草地HS级分处理的黑松愈伤组织的生物量和相对生长速率Tab.4 Biomass （expressed as percentage compared to control） and relative growth rate （RGR）of Pinus nigra callus exposed to different hormones and forest or grass humic fractions

Muscolo和Sidari尝试更深入地研究HS化学组分和生物活性之间的关系。他们利用亲和色谱，在弱碱性氨基树脂中分离出HS的羧基和酚类组分，分析了HS萃取物和级分的物理和化学特性，比较了不同条件下的欧洲黑松阿诺德愈伤组织生物效应。研究表明，与HS酚基类级分相比，未分级的HS和羧基级分的分子量更高、芳香性程度更大。利用13C核磁共振和漫反射红外傅里叶变换光谱研究发现，HS羧基级分中含有低分子量木质素、芳香族化合物和高含量的碳氢化合物。HS酚类级分中含有具有抑制效果的高含量的脂肪酸和酚酸。相比之下，羧基级分促进了愈伤组织的生长，提高了酶活性。以上结果表明，HS级分具有积极的生物效应，原因可能是其含有大量的氨基酸、碳水化合物和羧基基团，以及低含量的酚酸和脂肪酸。

随后Muscolo等研究了HS酚类级分和羧基级分对拟南芥幼苗生长的影响，研究结果表明，HS酚类级分对幼苗生长具有抑制作用，HS羧基级分对其无影响。结果还表明，HS对植物生长发育具有抑制效果的主要原因是其中高的酚酸和脂肪酸含量。

D，Orazio和Senesi对HS的结构和活性关系的最新研究认为，化学组分对植物生长和代谢的生物效应影响很大。HS的结构和组分的差异似乎取决于植物种类和生长阶段，这主要应归于部分并入到根际的HA，其为根分泌物，例如低分子量的氨基酸、酰胺、脂肪酸和芳香酸，多糖和糖类、脂肪酸和甾醇类、酶类中的典型组分。总之，这些结果也表明，土壤环境中不同数量及种类的HS化学组分可能导致每个HS的活性不同。此外，HS中的有机化合物及类HS物质直接或间接影响了植物活性，进而防治了不同土传病害引起的植物病害，特别是植物根际病害。

同样，Litterick等和Loffredo等研究了HS在控制真菌生长方面的功效，研究表明，HS的浓度、类型及结构和功能均可影响真菌生长，HS的总酸度、羧基和构成HS的化学元素等防治了真菌引起的植物病害。

总之，从表5中可以看出，采用不同提取方式制得、不同分子量和化学结构的HS对不同植物的种子发芽、生长和新陈代谢等方面均具有生物效应。在不同实验条件下，HS活性主要与其化学结构和组成有关。

表5　HS不同级分对不同植物种类的生物活性研究和HS结构与活性关系的假设Tab.5 Studies on biological activity of different humic fractions on different plant species， and hypothesis on relationship between structure-activity

2　根系形态

研究人员常研究土壤中HS及其级分对根系生长的影响，主要是因为根系是土壤中HS最先接触的器官。Schmidt和Pinton等研究了水提取的HS（WEHS）对拟南芥根系生长的影响，发现根毛长度和密度显著增加，异位根毛形成，根的基本组织细胞增殖。他们指出，WEHS通过增加根系的吸收表面积诱导了一个“营养获取反应”，有利于营养素的摄取。作者还进一步证实了WEHS的应用影响了决定表皮细胞命运细节的相关基因，能够改变根细胞分化早期阶段的发育过程。在WEHS的存在下，编码根毛细胞命运的负调控因子，被明显抑制。因此，HS的存在引起有序的根形态重构，导致根系的吸收表面增加。随后Tomasi等研究了在Fe的获得和运输过程中WEHS的参与，结果表明，在某种程度上，Fe和WEHS级分的络合激活了Fe在叶片的获得机制。Canellas等用交叉极化魔角旋转核磁、电子顺磁共振和HPSEC评估了巴西6种不同风化程度的热带土壤对植物生长的结构特性和生物活性的影响。HS表现出来的疏水性和酸性官能团特性，对刺激植物生物活性有着良好的效果。Canellas等也研究了巴西7种热带和亚热带地区氧化土中HA对玉米幼苗根系生长的影响，细胞质膜中H+-ATP酶活性变化及在根细胞中的表现被认为是HA生物活性的生理标记，并且所有的HA促进了根系生长，提高了玉米囊泡中的质子泵活性。与对照相比，一些HA处理促进了根系生长，也有一些HA处理增加了根系密度，这与HA疏水性密切相关。虽然HA的疏水性以协同方式进行，但是HA分子大小和碳含量的关系是次要的。Loffredo等对不同土层中的HA进行评价，表明土的类型和浓度显著促进了盆栽胡椒草的发芽和苗期生长，原因可能是上层土中缩聚HA富含C、H、N、酚羟基，使得HA具有疏水性，进而促进了根系生长。

Muscolo等研究了森林土中的HS的羧基和酚类级分对拟南芥幼苗生长的影响。研究表明，与酚类级分（FII）相比，普通HS（F0）和羧基级分（FI）具有较高的芳香性。其中FI级分中含有大量的羧基和总糖，FII级分中含有脂肪酸和酚酸。特别是高浓度的FII级分（5 mg·C/L）显著抑制主次根系生长，对植物表现出急性应激。相反地，FI级分抑制了侧根生长，但与浓度不相关，表明FI级分主要是促进根系伸长，而不是增加侧根数量。因而，HS级分具有不同生物效应，其原因可能是HS组分、含量等不同，也可能是添加剂或抗体等单一化合物的交互作用所导致的。

3　类生长素活性

HS结构和活性的复杂性也与其他分子有关，如微生物分解得到的吲哚乙酸（IAA），但还未确定HS与根细胞及植物生理和生长的交互作用机制。有研究表明，HS对植物的积极生物效应主要是因为其类生长素活性，但是这一假设还在讨论中。

Muscolo等利用不同方法检测了HS中IAA的特异性（表6），研究结果表明，特异性抗体和反IAA抗体能抑制HS的生物活性。同样，在豆瓣菜的研究中也发现此规律（表7），IAA和HS均可显著抑制根系生长。抗体与IAA-或HS级分抗原密切相关（表7）。HS的类生长素活性对细胞质膜H+-ATP酶的影响或对微量元素的有效性受到质疑。这些结论没有完全考虑到HS的复杂性。众所周知，不同土壤中的植物生长素含量不同，肥沃土壤中植物生长素含量较高。在最新研究成果中得到了验证。Russell等研究了低含量游离IAA的2种分子量不同的蚯蚓HS级分，以及磷脂酶A2对豌豆突变银叶的气孔张开的影响。这2种HS级分均能导致气孔张开，其用量和有效浓度一致。2种HS所导致的最大气孔开度一致，原因主要是IAA，其次是光线或壳梭孢素。磷脂酶A2的2种抑制剂选择性阻塞IAA和HS影响下张开的气孔，而对光线或壳梭孢素影响下张开的气孔无影响。总之，植物生长素和HS作用下的气孔张开与光线或壳梭孢素影响下磷脂酶A2的活化作用有关。研究认为，不同分子量和IAA含量的HS级分均具有独自的生物活性。

表6　HS中IAA含量的测定方法Tab.6 IAA detected in humic substance with analytical methods

表7　有、无IAA抗体条件下IAA和HS处理对豆瓣菜根系生长的离体影响Tab.7 In vitro effects of IAA and humus both in presence and in absence of antibody anti-IAA on root growth of watercress

HA对植物根系发育产生影响，Dobbss等研究发现，相比对照组，添加HA显著升高了拟南芥的侧根数量。但是，同样的处理并未对微型番茄产生显著影响，这是由于这种番茄对生长素不太敏感。这种现象被认为是HA具有类生长素活性的佐证。然而，一些有机物级分除了提高侧根数量，还可诱导增加主根的长度，而对主根生长的促进作用并非是生长素的典型效应，说明这些物质中可能含有其他具有生理活性的物质。

Schiavon等研究了一种含IAA（27 nmol/mg·C）的高分子量HS级分（＞3500 Da）对玉米苯丙烷代谢的影响。结果表明，随着HS浓度的升高，HS显著降低了苯基丙氨酸和酪氨酸含量，但显著升高了酚类化合物的含量，即，本研究中HS的影响可部分归因于HS级分中含有的IAA，该HS级分显著影响植物苯丙烷代谢等次生代谢，如IAA的一般作用。

Mora等做出了如下假设：HS对植物的影响主要涉及根系H+-ATP酶活性和硝酸盐在根稍的分配，从而改变某些细胞分裂素、多胺和脱落酸在根稍的分配，最终对新稍生长产生影响。上述影响与新稍中几种细胞分裂素和多胺（主要是腐胺）含量升高根系中含量减少有关。

有证据表明，主体HS中植物生长素的单一存在并不足以证明HS对植物的影响机理。鉴于此，一些学者做出了如下假设：在HS结构中应存在其他信号分子或者不同的代谢信使参与调控HS的效应。一些相关的研究工作也在进行。Mora等验证了细胞分裂素和脱落酸的参与机制，Zandonadi等对NO信号耦合到IAA的应答进行了研究。为了更好地阐明HS的类生长素活性，许多研究者采用了分子生物学技术。Trevisan等研究了HS对拟南芥侧根形成的生物效应，并测定了HS中内源IAA的含量；运用遗传和分子相结合的方法来确定HS在拟南芥侧根形成过程中所起到的类生长素活性。利用生长素运输或者行动的特定抑制剂获得的数据表明，HS主要是通过其“生长素活性”来诱导侧根的形成。这些研究结果进一步证实了HS用于激活生长素合成DR5∶∶GUS，以及增强早期生长素应答基因IAA19的转录。Trevisan等基于cDNA-AFLP标记技术，通过转录组方法识别拟南芥中可能参与HS应答机制的候选基因。研究结果表明，HS通过复杂的转录网络对植物生理产生影响。基于整体的转录组结果，做出了如下假设：HS是通过一个多方面的作用机制来发挥其功能，部分与其很好的类生长素活性相关，也包括独立于IAA的信号通路。

4　结论

最初，众多有关HS生物活性的结果和调查存在争议，但经过更为深入的研究之后，HS的生物活性得到了明确的结果。显然，HS中生长素的单一存在并不能充分证明其生物反应。鉴于此，一些学者做出了如下假设：在HS结构中应存在其他信号分子或者不同的代谢信使参与调控HS的效应。

除HS级分的疏水性和柔性构象结构之外，HS的正生物效应也与其化学组分密切相关，特别是官能团、碳水化合物含量、类糖组分、低含量木质素、低含量酚酸和脂肪酸、大量的其他非木质素芳香族化合物等。为了阐明HS中分子间相互作用和建立HS活性与其结构更为准确的关系，还需要进一步深入研究。

（略）

译自：Journal of Geochemical Exploration，2013，129：57～63。

Humic Substance： Relationship between Structure and Activity

A. Muscolo1， M. Sidari1， S. Nardi2write Lu Yanyan3，4， Wu qinquan3，4， Hong Pizheng3，4， Chen shigeng3，4， Ding fangjun3，4，5*translate

（1 Dipartimento di Gestione dei Sistemi Agrarie Forestali， Università degli Studi “Mediterranea” di Reggio Calabria in Italy， Reggio Calabria， 89060 2 Dipartimento di Biotecnologie Agrarie， Università di Padova in Italy， Padova， 35020 3 Shandong Agricultural University Fertilizer Science & Technology Co.， Ltd.， Tai'an， 271000 4 Engineering and Technology Research Center of High Efficient Utilization of Humic Acid of Shandong Province，Tai'an， 271000 5 College of Resources and Environment， Shandong Agricultural University， Tai'an， 271018）

The complexity of humic substances （HS） and their remarkable properties in agricultural applications has attracted and continue to attain the attention of many investigators， bringing over the years new knowledge on their structure， physicochemical and biological properties. Nevertheless， the numerous studies produced controversial results because of the difficulty to identify a precise relationship between the structure and the activity of these substances. Evidences presented here showed that the effects of HS on plant growth depends on the source， concentration and molecular weight of humic fractions and mainly on different chemical compounds contained into them. Humic matterappears also to display a hormone-like activity in particular an auxin like activity. It is not clear if this activity is strictly linked to the chemical structure of HS or whether it depends on hormones of microbial origin such as indole acetic acid entrapped into them. In any case， HS exhibit stimulatory effects on plant cell growth and development. In this review，the relationship between humic substance structure， chemical composition and physiological effects on plant growth and metabolism are examined. In particular， the responses of plants to humic substances are described， as well as the regulatory circuits that allow plants to cope with humus. Furthermore， how the present findings can add new information to the humic substances issue is widely discussed.

auxin； biological effects； callus growth； chemical composition； humic substances； root growth

S153.6+22

A

1671-9212（2016）05-0038-08

2015-09-30

路艳艳，女，1990年生，硕士，主要研究方向为新型肥料研发、肥料应用技术研究。*通讯联系人：丁方军，男，教授，E-mail：sdndfyjs@163.com。