CD40基因多态性及血清水平与系统性红斑狼疮发病机制的相关研究

吴成将 袁秋然 莫益姣 梁丽群 王春芳 蒋远文 蓝艳

533000广西百色市，右江民族医学院附属医院检验科（吴成将、袁秋然、莫益姣、梁丽群、王春芳），皮肤科（蒋远文、蓝艳）

CD40基因多态性及血清水平与系统性红斑狼疮发病机制的相关研究

吴成将 袁秋然 莫益姣 梁丽群 王春芳 蒋远文 蓝艳

533000广西百色市，右江民族医学院附属医院检验科（吴成将、袁秋然、莫益姣、梁丽群、王春芳），皮肤科（蒋远文、蓝艳）

目的 探讨CD40基因单核苷酸多态性（SNP）及其单倍型与SLE易感性的相关性，分析CD40基因型及血清水平与系统性红斑狼疮（SLE）的相关性。方法 单碱基延伸的PCR技术（PCR-SBE）和DNA测序法分析 205例 SLE患者和 220例健康对照 CD40基因 rs1883832 C/T、rs13040307 C/T、rs752118 C/T和rs3765459 G/A的多态性，同时用ELISA检测血清CD40水平。结果 与健康对照组相比，SLE组血清CD40水平显著增高（P＜0.05）。SLE组与健康对照组CD40基因rs1883832 C/T位点基因型和等位基因频率比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。等位基因频率的相对风险分析后发现，携带有rs1883832 T等位基因的受试者患有SLE的风险是 rs1883832 C等位基因的 1.517倍（OR=1.517，95%CI1.157～1.990，P=0.003）；携带 rs1883832 T等位基因的SLE患者血清CD40水平与不携带者相比，结果显著增高（P＜0.01）。通过联合基因型分析发现，SLE组中携带单倍型TCCA的患者较健康对照组显著增加了发病的风险（OR=2.322，95%CI1.181～4.564，P=0.012）。结论 CD40基因rs1883832 C/T多态性和TCCA单倍型与SLE的发病有相关性，其中rs1883832 T等位基因可能是SLE的遗传易感基因。

红斑狼疮，系统性；抗原，CD40；多态性，单核苷酸；单倍型；基因型；等位基因

系统性红斑狼疮（SLE）是一种好发于青年女性的累及多脏器的自身免疫性疾病。本病病因至今尚未肯定，普遍认为与遗传、内分泌、感染、免疫异常和环境等多种因素有关。研究表明，遗传因素在SLE的易感性中起着重要的作用［1-3］。CD40是一种肿瘤坏死因子受体超家族成员，在上皮细胞、平滑肌细胞等非免疫细胞以及B细胞、巨噬细胞和树突细胞等免疫细胞上均有表达。已有研究表明，CD40基因多态性与类风湿性关节炎［4］、Graves 病［5］等多种自身免疫疾病遗传易感性有关联。因此，我们对CD40基因 rs1883832 C/T、rs13040307 C/T、rs752118 C/T 和rs3765459 G/A多态性及单倍性与SLE疾病遗传易感性的关系进行了研究。

对象与方法

一、对象

收集2013年10月至2014年11月在本院风湿免疫科就诊的SLE患者205例，其中男36例，女169例，年龄30～82岁；SLE的诊断标准符合1997年美国风湿病学会修订的SLE分类诊断标准。本院健康体检者220例，其中男42例，女178例，年龄29～78岁。以上研究对象均来自广西，彼此无血缘关系。本研究通过医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

二、方法

1.基因组DNA提取：用EDTA-K2抗凝管采集受试对象的静脉血2 ml，白细胞基因组DNA的提取方法，参照已建立的改良碘化钠法［6-7］。

2.引物设计与合成：根据CD40基因rs1883832 C/T、rs13040307 C/T、rs752118 C/T 和 rs3765459 G/A位点多态性和已知的DNA序列设计PCR引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特异扩增CD40基因包含rs13040307 C/T位点的上下游引物序列分别是：5′-GGCTGGATGACCCTGTGAGAGA-3′，5′-AGCCAGGACCCTGCCTGCTA-3′，其延伸引物序列是：5′-AGCCAGGACCCTGCCTGCTA-3′；用于特异扩增CD40基因包含rs3765459 G/A位点的上下游引物序列：5′-CCACTGGC TCCCACTCTGGA-3′，5′-GGTGGGTGCAGCCTCACTGT-3′，其延伸引物序列：5′-TCCCCCCTTTCCCAGACGG-3′；用于特异扩增CD40基因包含rs1883832 C/T位点的上下游引物序列：5′-GGACCTGGGGGCAAAGAAGA-3′，5′-CCCACTCCCAACTCCCGTCT-3′，其延伸引物序列：5′-TTTTTTTTTTTTGCAGAGGCAGACGAACCAT-3′；用于特异CD40基因包含rs752118 C/T位点的上下游引物序列与用于扩增包含rs1883832 C/T位点的上下游引物序列相同但延伸引物不一样，其延伸引物序列：5′-TTTTGTGTACGGGAGGAGG CATG-3′。

3.PCR扩增：CD40的PCR扩增反应体系共为20 μl，其中包含了 10 × PCR 缓冲液 2 μl，0.3 mmol/L dNTP 2 μl，上、下游引物均为 1 μl，模板 DNA 1 μl，TaqDNA聚合酶1 U，体积若不足，则用灭菌双蒸水补足至 20 μl。PCR产物用德国 Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR来获得，PCR产物通过虾碱酶（美国Promega公司）和外切酶Ⅰ（美国Epicentre公司）纯化后用美国ABI公司的SNaPshot Multiplex试剂盒进行延伸反应。延伸的产物用虾碱酶纯化后在ABI3730XL上样。用GeneMapper4.1来分析SNP分型。

4.血清CD40水平的检测：用ELISA测定CD40血清水平，按照试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）说明书操作。

5.统计学处理：用SPSS11.5软件包进行统计分析。SLE组与健康对照组各基因型间血清CD40水平的比较用±s表示，组间比较采用独立样本的t检验。各等位基因和基因型分布频率均采用直接计数法计算，各组间等位基因和基因型分布频率比较均采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、CD40基因多肽性检测结果

CD40基因 rs1883832 C/T、rs13040307 C/T、rs752118 C/T和rs3765459 G/A多态性，经PCR扩增后的产物片段分别为 374、183、374、372 bp。SNP 分型结果显示 rs1883832 C/T、rs13040307 C/T和rs752118 C/T位点均存在CC、CT和TT 3种基因型；rs3765459 G/A位点存在GG、GA和AA 3种基因型。基因测序再一次验证了我们的检测结果（图1～4）。

二、SLE组和健康对照组CD40基因多态性的比较

在两组人群中，CD40基因型分布频率，均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，说明所选对象具有一定的群体代表性。SLE组与健康对照组CD40基因rs1883832 C/T位点基因型和等位基因频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。CD40基因rs13040307 C/T、rs752118 C/T和 rs3765459 G/A多态性在 SLE组和健康对照组中分布比较，差异无统计学意义（均P＞0.05，表1）。此外，我们分析了SLE组中CD40基因rs1883832 C/T位点基因型和临床表型之间的相关性，发现SLE组中，rs1883832 C/T多态性TT和CT基因型携带者中患有肾炎和白细胞减少症的人数比CC基因型携带者明显增加（P＜0.05，表 2）。

图1 CD40基因rs1883832 C/T测序图 1A～1C：分别表示CC、CT和TT基因型；箭头所示为基因突变位点 图2 CD40基因rs13040307 C/T测序图 2A～2C：分别表示CC、CT和TT基因型；箭头所示为基因突变位点 图3 CD40基因rs752118 C/T测序图 3A～3C：分别表示CC、CT和TT基因型；箭头所示为基因突变位点 图4 CD40基因rs3765459 G/A测序图 4A～4C：分别表示GG、GA和AA基因型；箭头所示为基因突变位点

表1 系统性红斑狼疮（SLE）组与健康对照组CD40基因多态性分布频率的比较［例（%）］

三、SLE组与健康对照组CD40基因的单倍型分析

CD40 （rs1883832 C/T/rs13040307 C/T/rs752118 C/T/rs3765459 G/A）基因单倍型分布频率的比较见表3。除SLE组TCCA基因单倍型携带者较健康对照组明显增加了发病风险（OR=2.322，95%CI1.181 ～ 4.564，P=0.012）外，其余差异无统计学意义（均P＞0.05）。

四、SLE组与健康对照组各基因型间血清CD40水平的比较

SLE组中血清CD40水平显著高于健康对照组，［（58.5 ± 22.8）pg/ml，n=205］比［（41.7 ± 13.2）pg/ml，n=220］；P ＜ 0.001，图 5。SLE组中CD40基因rs1883832 C/T多态性TT和CT基因型血清CD40水平较CC基因型明显升高，差异有统计学意义［（62.6±23.3）pg/ml，n=53］或［（59.9 ± 22.6）pg/ml，n=105］比［（50.7 ±20.4）pg/ml，n=47］，P ＜ 0.01，而 CT 基因型和 TT基因型携带者血清CD40水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05，图6）。

表2 CD40基因rs1883832 C/T基因型分布频率和临床表型的相关性［例（%）］

表3 系统性红斑狼疮（SLE）组与健康对照组CD40基因单倍型分布频率的比较［例（%）］

图5 系统性红斑狼疮组血清CD40水平显著高于健康对照组a：与健康对照组比较，P＜0.01

图6 系统性红斑狼疮组中CD40基因rs1883832 C/T多态性TT和CT基因型血清CD40水平较CC基因型明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），CT基因型和TT基因型携带者血清CD40水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05） a：分别与CC基因组比较，P＜0.01

讨 论

Duffau等［8］发现，SLE患者中血小板源性CD40L与浆细胞样树突细胞上表达的CD40相互作用分泌干扰素 α。Koshy 等［9］证明 CD40-CD40L 共刺激分子通路在SLE的发病机制中具有重要作用。此外，Boumpas等［10］发现，使用人源化抗 CD40L 抗体治疗弥漫增生性狼疮性肾炎能够降低患者体内抗dsDNA抗体水平，增加C3浓度并且降低血尿等症状。本研究显示，SLE组血浆sCD40水平明显高于健康对照组，结果表明，CD40可能与SLE患者发病有关。

已有学者对CD40基因和SLE相关性进行了研究，但这些研究结果并不一致。Vazgiourakis等［11］研究表明，CD40中rs4810485 G/T和T/T基因型与希腊和土耳其人SLE遗传易感性有相关性。Piotrowski等［12］报道，在波兰人群中，CD40 基因 rs4810485G/T多态性和SLE之间无显著相关性。但是，Lee等［13］发现，CD40基因rs4810485G/T多态性的基因型以及等位基因频率在欧洲人群SLE组和健康对照组间差异有统计学意义。Joo等［14］证明，韩国人中CD40基因rs1883832C/T和SLE差异无统计学意义。我们研究结果显示，在中国人群中CD40基因rs1883832C/T和SLE的发病有显著的联系。等位基因频率的相对风险分析发现，rs1883832T等位基因携带者患SLE的风险是C等位基因的1.517倍（OR=1.517，95%CI1.157 ～ 1.990，P=0.003），提示rs1883832T等位基因也许是SLE的又一个遗传易感基因。进行联合基因型分析，我们进一步发现，SLE组中携带单倍型TCCA的患者携带较健康对照组明显增加了发病的风险（OR=2.322，95%CI1.181 ～ 4.564；P=0.012）。结果提示，CD40 基因rs1883832 C/T多态性和单倍型TCCA同SLE的发病具有相关性。然而，我们并没有发现rs13040307 C/T，rs752118 C/T，rs3765459 G/A 多态性和 SLE 的遗传易感性有关。此外，我们还检测了SLE组和健康对照组血清CD40水平，结果显示，SLE组血清CD40水平显著高于健康对照组，表明CD40可能参与SLE的发病。通过分析CD40基因多态性和血清CD40水平之间的关系，我们发现，携带rs1883832T等位基因的SLE患者血清CD40水平显著高于不携带者，另外，我们分析了SLE组中CD40基因rs1883832 C/T位点基因型和临床表型之间的相关性，发现SLE组中，rs1883832 C/T多态性TT和CT基因型携带者中患有肾炎和白细胞减少症的人数较CC基因型携带者明显增加，故认为病理状态下，携带rs1883832T等位基因的患者可提高血清sCD40的表达，从而增加SLE的发病风险。

综上所述，多种因素参与SLE的发病机制，遗传易感基因在其中起着重要作用。我们的研究已经证明CD40基因rs1883832 C/T多态性和TCCA单倍型与SLE具有相关性，其中，T等位基因可能是SLE的遗传易感基因。CD40基因多态性与SLE的确切分子机制尚未阐明，需要进一步研究。

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（本文编辑：吴晓初）

第六届全国激光美容与面部年轻化学术大会暨第五届全国微创美容学术大会征文通知

由中国医师协会美容与整形医师分会主办的第六届全国激光美容与面部年轻化学术大会及第五届全国微创美容学术大会定于2016年5月5-8日在上海跨国采购会展中心召开，现就激光与微创美容的内容进行征文，热忱欢迎各位同道和专家积极参与，将最新的工作经验及科研成果展示给大家，以促进同行间的学习、交流与进步。

征文内容：各类损容性问题皮肤的光电治疗技术；瘢痕的激光与非手术治疗技术；光电技术与注射美容技术在面部年轻化中的联合应用；眼周、口周、鼻周、颈部皮肤的精细化美容；光电设备在溶脂塑身中的应用；私密部位的精细化美容技术；光动力医学美容的临床与进展；色素性血管性皮肤病的治疗进展；皮肤无创检测技术；干细胞美容技术等抗衰老医学新进展；疑难病例讨论与典型病例展示；人体美学及美容心理学的相关内容；国际激光美容行业发展现状与趋势；激光美容技术的行业应用与融合发展；肉毒毒素注射的临床与解剖；玻尿酸注射的临床与并发症；其他注射类产品的注射美容；脂肪注射美容；微针注射美容；美容护理与咨询管理；互联网与医美等相关内容。

征文要求：①论文应具有较高的科学性、先进性和实用性，且未在任何刊物上正式发表；②文体形式不限，论著、综述、述评、个案等。请提交500字左右的中文摘要，论文格式请按文题、单位地址、邮编、作者姓名、电话号码或电子邮箱、摘要的顺序排列；③稿件格式要求office2000以上word形式，视频以AVI、mp4、MOV等常见格式为主。

投稿邮箱：zhengwen2016cmda@163.com，截稿日期：2016年2月28日，联系人：王玉芝，13268260567。

Association of CD40 gene polymorphisms and serum CD40 levels with the pathogenesis of systemic lupus erythematosus

Wu Chengjiang,Yuan Qiuran,Mo Yijiao,Liang Liqun,Wang Chunfang,Jiang Yuanwen,Lan Yan
Department of Clinical Laboratory,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,Guangxi,China （Wu CJ,Yuan QR,Mo YJ,Liang LQ,Wang CF）;Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,Guangxi,China（Jiang YW,Lan Y）

ObjectiveTo explore the association of CD40 gene single nucleotide polymorphisms （SNPs）and haplotypes with the susceptibility to systemic lupus erythematosus（SLE）,as well as the association of serum levels and genotypes of CD40 with the occurrence of SLE.MethodsA multiplex PCR single-base extension assay（PCR-SBE）and DNA sequencing were performed to analyze 4 SNPs of the CD40 gene,including rs1883832 C/T,rs13040307 C/T,rs752118 C/T and rs3765459 G/A,in 205 patients with SLE （SLE group）and 220 healthy human controls（control group）.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to measure serum levels of CD40 in these subjects.ResultsCompared with the control group,the SLE group showed significantly increased serum levels of CD40（P＜0.05）.There were significant differences in genotype and allele frequencies of the SNP rs1883832 C/T in the CD40 gene between the SLE group and control group （allP＜0.01）.Relative risk analysis showed that the risk of developing SLE in rs1883832 T allele carriers was 1.517 times that in rs1883832 C allele carriers（OR=1.517,95%CI:1.157-1.990,P=0.003）.Moreover,serum levels of CD40 were significantly higher in rs1883832 T allele carriers than in rs1883832 C allele carriers（P＜0.01）.The risk of developing SLE was significantly increased in TCCA haplotype carriers compared with the healthy controls（OR=2.322,95%CI:1.181-4.564,P=0.012）.ConclusionThe CD40 gene rs1883832 C/T polymorphism and its TCCA haplotype were both associated with the occurrence of SLE,and the rs1883832 T allele may be a gene predisposing to SLE.

Lupus erythematosus,systemic;Antigens,CD40;Polymorphism,single nucleotide;Haplotypes;Genotype;Alleles

Lan Yan,Email:yylanyan@163.com

2015-06-04）

蓝艳，Email：yylanyan@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.01.003

国家自然科学基金（81260234）；广西医疗卫生重点科研课题（Z2012086）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81260234）;Key Program for Medical and Health Research in Guangxi Zhuang Autonomous Region（Z2012086）