高效液相色谱法测定补脑安神片中二苯乙烯苷含量

王红，杨慈海，宋军

（1.湖北省荆州市妇幼保健院，湖北荆州434020；2.湖北省荆门市食品药品监督检验所，湖北荆门448124）

高效液相色谱法测定补脑安神片中二苯乙烯苷含量

王红1，杨慈海2，宋军2

（1.湖北省荆州市妇幼保健院，湖北荆州434020；2.湖北省荆门市食品药品监督检验所，湖北荆门448124）

目的建立测定补脑安神片中2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O- -D-葡萄糖苷含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法色谱柱为Lichrom C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流动相为乙腈-水（20∶80），流速为1 mL/min，检测波长为320 nm。结果2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O- -D-葡萄糖苷进样量在0.209 2～3.347 2 g范围内与峰面积积分值线性关系良好（r=0.999 9），平均回收率为98.89%，RSD=0.76%（n=6）。结论该方法简便、准确，可用于补脑安神片中制何首乌的质量控制。

高效液相色谱法；补脑安神片；二苯乙烯苷；含量测定

补脑安神片由当归、制何首乌、女贞子、酸枣仁（生、炒各半）、黄精（蒸）、茯苓、合欢皮、墨旱莲、朱砂、远志、桑叶等11味中药精制而成，具有补肝益肾，养血安神的功效，用于肝肾不足所致头痛眩晕、心悸不宁、失眠多梦、健忘。国家药品标准中只有性状和显微鉴别，无含量测定项［1］。补脑安神片方中，何首乌有增强免疫和保肝护肾的作用［2］，为君药。现代药理研究表明，其主要有效成分二苯乙烯苷具有抗氧化及清除自由基、抗兴奋性毒性、调节Bcl-2蛋白及海马基因表达等多种功效，能直接或间接发挥脑保护作用［3-4］。本研究中参照2010年版《中国药典（一部）》及文献［5-10］，对处方中制何首乌中所含有效成分2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷采用高效液相色谱（HPLC）法进行了含量测定，效果好，方法简单可行，可作为提高该制剂质量标准的参考依据。

1　仪器与试药

Ultimate 3000型高效液相色谱仪、Ultimate 3000 Diode Array Detector型紫外检测器及Chromeleon色谱工作站（美国Dionex公司）；BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；AS20500A型超声波清洗器（天津奥特赛恩仪器有限公司）。2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110844-200607，供含量测定用，含量为100.00%）；补脑安神片（武汉钧安制药有限公司，批号分别为141101，141201，150202）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Lichrom C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；预柱C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（20∶80）；流速：1 mL/min；检测波长：320 nm；进样量：10 μL。在上述色谱条件下，理论板数按2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于2 000［5］，分离度大于1.5。

2.2溶液制备

对照品溶液：精密称取置五氧化二磷减压干燥器中干燥24 h的2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品10.46 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇约30 mL，超声5 min使溶解，冷却，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（0.209 2 mg/mL）。

供试品溶液：取本品20片，除去糖衣，精密称定6.231 8 g，平均片重0.311 6 g，研细，称取0.646 0 g，置锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，水浴加热回流30 min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液备用（在8 h内使用）。

阴性对照品溶液：按处方比例取除制何首乌以外的其他药材，以相同工艺制备，按供试品溶液制备方法制备缺制何首乌阴性对照溶液。

2.3方法学考察

专属性试验：分别取2.2项下3种溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液相应位置上，有相同保留时间的色谱峰，阴性对照无干扰。见图1。

线性关系考察：分别精密吸取对照品溶液1，2，4，8，16 μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积积分值，以进样量（X）为横坐标，以峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：Y=414 519 X+53 151，r= 0.999 9。结果表明，2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷进样量在0.209 2～3.347 2 μg范围内与峰面积积分值线性关系良好。

精密度试验：精密吸取对照品溶液10 μL，重复进样5次，测定峰面积。结果峰面积的RSD=0.95%（n=5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一批（批号为150202）供试品溶液，分别于0，2，4，6，8 h时进样，测定峰面积。结果峰面积的RSD=1.27%（n=5），表明供试品溶液在8 h内基本稳定。

重复性试验：取同一批（批号为150202）样品粉末适量，共6份，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订方法测定。结果平均含量为2.33.0 mg/g，RSD=1.33%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的同一批（批号为150202，含量为2.330 mg/g）样品粉末约0.35 g，平行取6份，精密称定，分别精密加入2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液（0.209 2 mg/mL）各3，3，4，4，5，5 mL，依法制备溶液并进样测定，计算回收率。结果见表1。

图1　高效液相色谱图

表1　加样回收试验结果（n=6）

2.4样品含量测定

取市售补脑安神片3批，依法制备供试品溶液，分别精密量取供试品溶液与对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算供试品溶液中2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量。结果见表2。

3　讨论

3.1指标成分选择

方中共11味中药，因制何首乌在处方中属君药，且用量大，其有效成分清楚，常作为含量测定对象，制何首乌中主要有效成分为2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和蒽醌类化合物，2010年版《中国药典（一部）》规定蒽醌类化合物不得少于0.1%，因含量较低，测定结果差异大，相对误差也较大，不好掌握，而2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量高，2010年版《中国药典（一部）》规定不少于0.7%［5］，且性质稳定，故选择2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷作为测定的考察指标。

表2　补脑安神片中二苯乙烯苷的含量测定结果（mg/片，n=3）

3.2提取溶剂选择

2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷为水溶性成分［9］，是20碳化合物，分子量较大，用甲醇和稀乙醇作为溶剂提取较好，因补脑安神片的制备过程中有3味是原药材入药，7味是用水煮提取浓缩绸膏入药，1味是70%乙醇渗漉液回收乙醇后入药，成药中含有较多淀粉和其他水溶性物质，特别是方中茯苓以原药材入药，含较高的β-茯苓聚糖，易溶于水，用稀乙醇提取易产生混浊，很难过滤，影响检测结果的准确性，用甲醇可避免淀粉溶解，糖类成分溶解也较少，提取液澄清，易过滤，又能很好地将2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷溶解出来，故选择甲醇作提取溶剂。

3.3提取方法选择

制何首乌用的是饮片原药入药，未事先水煮提取，经过对提取方法的考察，结果表明，超声提取和加热回流提取存在较大差异性，故选择加热回流提取，且回流时间30 min以上可提取完全。

3.4流动相选择

［5］，采用乙腈-水（25∶75）为2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷流动相，样品主峰出峰快，6 min即可出峰，但样品与杂质峰未达到完全分离，不断改变流动相比例，增加水相比例，当乙腈-水（20∶80）为流动相时，样品与杂质完全分离，且2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的保留时间为10.16 min，时间较好，分离效果也好，故确定乙腈-水（20∶80）为流动相。

3.5检测波长选择

取2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液（0.209 2 mg/mL）在250～450 nm波长范围内扫描，结果2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在（320±1）nm波长处有最大吸收，因320 nm是中紫外区，有稳定的吸收，且基线平稳，因此参照2010年版《中国药典（一部）》［5］选择320 nm作为检测波长。

目前，国内HPLC法测定2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷已有广泛应用和报道［6-10］，也有用紫外光谱（UV）法测定2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的报道，因本处方有11味药材入药，很难提取分离纯化的2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的样品溶液，而HPLC法可达到较好分离，且快捷、简便、易行，可为提高质量控制标准提供参考依据。

［1］WS3-B-2335-97，卫生部药品标准·中药成方制剂（第十二册）［S］.

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［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：165.

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片中二苯乙烯苷的含量［J］.中国药业，2013，22（9）：16-17.［7］张舒.HPLC法测定养血安神糖浆中2，3，5，4’-四羟基二

苯乙烯-2-O- -D-葡萄糖苷和毛蕊花糖苷的含量［J］.中国药师，2013，16（3）：381-384.

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Determination of the Content of 2，3，5，4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside in Bunao Anshen Tablets by HPLC

Wang Hong1，Yang Cihai2，Song Jun2
（1.Jingzhou Maternal and Child Health Care，Jingzhou，Hubei，China434020；2.Jingmen Institute for Food and Drug Control，Jingmen，Hubei，China448124）

ObjectiveTo establish an high-performance liquid chromatography method for the content determination of 2，3，5，4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside in Bunao Anshen Tablets.M ethodsSeparation was achieved on a Lichrom C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with acetonitrile-water（20∶80）as mobile phase；the detection wavelength was 320 nm；the flow rate was 1 mL/min.ResultsThere was a good linear relationship（r=0.999 9）at the concentration range of 0.209 2-3.347 2 μg for2，3，5，4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside.Themeanrecoverywas98.89%withRSD=0.76%（n=6）. ConclusionThe method is simple and accurate.It can be used for the quality control of Bunao Anshen Tablets.

HPLC method；Bunao Anshen Tablets；2，3，5，4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside；content determination

R284．1；R286．0

A

1006－4931（2016）16－0072－03

王红（1967-），女，大学本科，副主任药师，主要从事医院药学工作，（电子信箱）jzwh1967@ 163.com；杨慈海（1965-），男，大学本科，主任药师，研究方向为药物分析，本文通讯作者，（电话）0724-8885050（电子信箱）1447558970@qq.com。

（2016－03－18；

2016－05－13）