细胞色素P4503A5和细胞色素P4502C19基因多态性对伏立康唑药代动力学的影响

黄金梅，陈桂香，李志平，袁娇

（1.广东省东莞市第五人民医院，广东东莞523900；2.广东省东莞市中医院，广东东莞523125）

细胞色素P4503A5和细胞色素P4502C19基因多态性对伏立康唑药代动力学的影响

黄金梅1，陈桂香2，李志平1，袁娇1

（1.广东省东莞市第五人民医院，广东东莞523900；2.广东省东莞市中医院，广东东莞523125）

目的分析细胞色素P450（CYP）3A5和CYP2C19基因多态性对伏立康唑药代动力学的影响。方法用RFLP-PCR法对20名健康男性志愿者进行CYP3A5和CYP2C19全血基因分型。所有志愿者单次口服伏立康唑片200 mg，采用液-质串联色谱法（LC-MS）测定志愿者不同时间点的血浆药物浓度，用DAS 2.0软件计算其药代动力学参数。用主效应模型单独分析CYP3A5和CYP2C19的半衰期（t1/2）、表观清除率（CL/F）、血药峰浓度（Cmax）、0～36 h药时曲线下面积（AUC0-36），以及药时曲线下总面积（AUC0-∞）。结果CYP3A5不同基因型伏立康唑的药代动力学参数均无明显差异（P＞0.05）；CYP2C19不同基因型的t1/2和Cmax均无显著差异（P＞0.05），而CL/F，AUC0-36及AUC0-∞差异显著（P＜0.05）；CYP2C19的CL/F，AUC0-36，AUC0-∞Scheffe法多重比较结果显示，CYP2C19突变纯合子的AUC0-36及AUC0-∞值显著高于野生组及突变杂合组（P＜0.05），而CYP2C19突变纯合子的CL/F值则明显低于野生组（P＜0.05）。结论CYP 2C19的基因多态性对伏立康唑的药代动力学有明显影响，而CYP 3A5的基因多态性对伏立康唑的药代动力学无明显影响。

细胞色素P4503A5；细胞色素P4502C19；基因多态性；伏立康唑；药代动力学

伏立康唑是目前临床应用广泛的第2代三唑类抗真菌药物［1］，化学结构与氟康唑类似，但活性更强，抗菌谱更广，且安全性高，尤其适用于治疗免疫缺陷患者进行性、威胁生命的感染［2］。伏立康唑口服吸收率极高，生物利用度可达90%［3］，但药代动力学在不同种族、不同个体间的差异极大。已有研究表明，同一种族中弱代谢者伏立康唑的血药浓度比强代谢者平均高4倍［4］。由于伏立康唑是通过抑制细胞色素450（CYP450）依赖性的14α-羊毛甾醇去甲基酶的活性而发挥作用［5］，与代谢相关的CYP450酶系主要为CYP3A5、CYP2C19，以及少量的CYP2C9［6-7］。本研究中主要探究存在多种基因型的CYP3A5和CYP2C19对伏立康唑药代动力学的影响，以期为临床用药提供一定的参考依据，现报道如下。

1　材料与方法

1.1仪器与试药

仪器：LCMS-8030型三重四极杆串联质谱仪（日本岛津公司）；Analyst 1.4.2数据处理软件（美国Applied Biosystem公司）；Agilent 1200型高效液相色谱系统（美国Agilent公司）；Thremo超速冷冻离心机（美国热电广东一级代理铭科公司）；Bio-Rad PCR仪（美国Bio-Rad伯乐公司）；凝胶成像系统（上海培清公司）；DYY-7C电泳仪（北京六一仪器厂）；微量元素型实验室专用超纯水机（济南海德水处理设备有限公司）。

试药：伏立康唑片（北京博康健基因科技有限公司，批号为20140921，规格为每片50 mg）；伏立康唑原料药（武汉英和制药有限公司，纯度大于99.0%，批号为20140627）；卡马西平原料药（内标，中国食品药品检定研究院，纯度大于99.0%，批号为0142-953）；全血DNA抽取试剂盒购自Omega公司；SuperMix含DNTps和EasyTaqDNA聚合酶，以及反应缓冲液；DNA Marker（Invitrogen公司）；琼脂糖粉（西班牙Biowest公司）；甲酸、乙腈、乙酸乙酯、甲酸等均为色谱纯，购自韩国SK chemicals公司。

1.2试验方法

1.2.1受试者选择

20名男性受试者均为医院的健康志愿者，平均年龄（22.28±1.66）岁，平均身高（171.23±3.64）cm，平均体重（61.55±5.31）kg，平均体重指数（22.13± 1.76）kg/m2，全面体格检查（心电图、血常规、肝肾功能）均正常。均签署知情同意书，研究内容经医院医学伦理委员会批准，采血过程在试验病房内完成。

1.2.2给药方法与血样采集

所有受试者禁食过夜12 h后，次日清晨空腹单次口服伏立康唑片200 mg，用200 mL温水送服。给药4 h后，统一标准饮食。给药前0.5 h，所有受试者在前臂静脉安置留置针，便于抽血。用药后0.25，0.50，0.75，1.00，1.50，2.00，3.00，4.00，6.00，12.00，24.00，36.00 h分别采集3.0 mL静脉血，并迅速注入含有肝素的抗凝管中，超速冷冻离心机以3 000 r/min的速率离心10 min后，取上层血浆，做好标记后置-20℃冰箱保存备用。

1.2.3血浆样品处理

取血浆样品10 μL，加入甲醇-水（50∶50）10 μL，内标溶液（1 0 μg/L的氟康唑溶液）10 μL，再加入萃取剂乙醚-二氯甲烷（2∶1）1 mL，涡流混合5 min，以3 500 r/min的速率离心5 min，取上清液于37℃空气流下吹干，残渣加入流动相200 μL，溶解，取5 μL分析。

1.2.4液-质患联色谱法（LC-MS）检测

色谱条件：色谱柱为Shimadzu Pack VP-ODS C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液=50∶50（V/V）；流速为0.2 mL/min；柱温为30℃；进样量为5 μL。

质谱条件：质谱的离子化方式为电喷雾离子化（ESI）；正离子检测方式（MRM）；喷元电压4 200 V；加热块温度300℃；碰撞气压力30 kPa，雾化气压力45 kPa；用于定量分析离子反应为伏立康唑（m/z）350.1→281.1，内标氟康唑（m/z）307.2→220.0。

1.2.5基因分型及PC条件RT

引物设计均由上海生工生物工程技术服务公司提供，基因分型有以下几种。①CYP3A5：上游引物5＇-CATCAGTTAGTAGACAGATGA-3＇，下游引物（5＇-GGTCCAAACAGGGAAGAAATA-3＇）；②CYP2C19＊2：上游引物5＇-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3＇；下游引物5＇-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3＇；③CYP2C19＊3：上游引物5＇-TATTATTATCTGTTAACTAATATGA-3＇，下游引物5＇-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3＇；④CYP2C19＊2：上游引物5＇-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3＇，下游引物5＇-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3＇。

PCR体系及酶切体系配制均按说明书准确操作。PCR体系：25 μL。；PCR反应条件：预变性95℃5 min，94℃变性30 s，退火温度55℃（CYP3A5，CYP2C19），72℃延伸30 s，72℃再延伸5 min；2%琼脂糖凝胶电泳分离。

6986A/G位点（CYP3A5基因）PCR扩增产物的片段长度为293 bp，经限制内切酶SsPI-HF酶切后有3种基因型。①野生纯合型（CYP3A5＊1/＊1，WT）：可经酶切后分为20，125，148 bp 3个片段；②突变纯合型（CYP3A5＊3/＊3，HO）：可经酶切后分为125，168 bp 2个片段；③突变杂合型（CYP3A5＊1/＊3，HE）：可经酶切后分为125，148，168 bp 3个片段。

CYP2C19＊2突变则Smal内切酶的酶切位点消失，野生型CYP2C19则还存有酶切位点。故CYP2C19弱代谢型则只存在1条169 bp的条带，CYP2C19强代谢型（EMs）则有49 bp和120 bp 2条带。CYP2C19＊2野生型和突变杂合子（CYP2C19＊1/＊2）则有49，120，169 bp 3条带。

1.3统计学处理

将测得的所有受试者用药后的血药浓度绘制成血药浓度-时间曲线；用DAS 2.1软件对测得的所有受试者的血药浓度进行数据处理，并计算出主要药代动力学参数；用SPSS 19.0统计软件对CYP3A5及CYP 4502C19和伏立康唑的药代动力学参数进行两两方差分析，观察其交互作用，同时比较其差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1LC-MS检测方法学考察结果

专属性试验：取6份来源不同的空白人血浆10μL，加入10.00μg/L的伏立康唑标准溶液10 μL；取受试者口服给药后血浆样品按1.2.3项下方法进行处理。在拟订分析条件下，伏立康唑和内标氟康唑的保留时间分别为2.45 min和2.08 min。结果表明，空白血浆中对伏立康唑和内标氟康唑的测定无干扰（见图1）。伏立康唑及内标药物的保留时间在3～4 min，峰形良好，分离较完全。且人血浆中内源性杂质不会干扰样品峰的检测，基线噪音较小，可以进行后续试验。

图1　高效液相色谱图

线性关系考察：取空白血浆10 μL，分别配制成10，50，200，500，1 000，3 000 μg/mL系列质量浓度的伏立康唑标准溶液，按照1.2.3项下方法进行血浆样品处理后分别进样。以待测物质量浓度（ρ）为横坐标，以待测物与内标物峰面积比值（A）为纵坐标，用加权（W=1/X2）最小二乘法进行回归运算，绘制标准曲线，得回归方程A=1.217×10-3ρ+1.780×10-3，r=0.9998（n=6）。结果表明，伏立康唑标准溶液质量浓度在12.359～2761.92μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度与回收率试验：取伏立康唑质量浓度为30，250，2 500 μg/L的质控样品，重复进样5次，连续测定3 d，根据当日的标准曲线计算日内、日间精密度及低、中、高各质量浓度回收率。结果见表1。

表1　血浆样品中伏立康唑的精密度与回收率试验结果（n=6）

稳定性试验：将血浆样品室温放置24 h，3次反复冷冻-解冻循环、长期（30 d）置于-20℃环境，样品试验测定值与标示量的相对偏差均小于15%，表明血浆样品稳定性良好。

2.2基因分型结果

CYP3A5基因分型：20名受试者经过RFLP-PCR后，其结果为3名CYP3A5＊1/＊1志愿者，占总数的15.00%；5名CYP3A5＊1/＊3志愿者，占总数的25.00%；12名CYP3A5＊3/＊3志愿者，占总数的60.00%。

CYP2C19基因分型：20名受试者经过RFLP-PCR后，其结果为7名CYP2C19＊1/＊1志愿者，占总数的35.00%；8名CYP2C19＊1/＊3或CYP2C19＊1/＊2志愿者，占总数的40.00%；5名CYP2C19＊2/＊3、CYP2C19＊2/＊2或CYP2C19＊3/＊3志愿者，占总数的25.00%。

2.3伏立康唑的药代动力学及分析

用主效应模型单独分析CYP3A5和CYP2C19的半衰期（t1/2）、表观清除率（CL/F）、血药峰浓度（Cmax）、0～36h药时曲线下面积（AUC0-36）及药时曲线下总面积（AUC0-∞）。CYP4503A不同基因型伏立康唑的药代动力学参数均无显著性差异（P＞0.05）；CYP2C19不同基因型的t1/2，Cmax无显著性差异（P＞0.05），而CL/F，AUC0-36，AUC0-∞差异显著（P＜0.05）。详见表2和表3。

表2　CYP3A5的主因素单方差分析结果（±s）

表2　CYP3A5的主因素单方差分析结果（±s）

注：WT为野生纯合型，HE为突变杂合型，HO为突变纯合型。表3同。

参数t1/2（h）C L / F（L / h）Cmax（n g / m L）A U C0-36（n g · h / m L）A U C0-∞（n g · h / m L）W T 4 . 3 ± 2 . 4 5 5 . 1 ± 2 7 . 5 1 0 3 9 . 8 ± 4 7 . 9 9 4 0 9 3 . 0 ± 1 6 5 9 . 8 4 2 0 5 . 9 ± 1 6 9 8 . 5 H E 7 . 5 ± 1 . 9 3 5 . 4 ± 7 . 6 1 3 2 2 . 1 ± 1 2 8 5 . 5 5 4 7 6 . 7 ± 1 2 8 6 . 1 5 8 5 4 . 1 ± 1 2 7 7 . 6 H O 5 . 9 ± 2 . 9 4 8 . 4 ± 2 3 . 8 1 5 7 0 . 8 ± 5 6 0 . 0 4 9 1 0 . 1 ± 2 6 5 5 . 4 5 1 6 2 . 3 ± 2 7 7 1 . 6

表3　CYP2C19的主因素单方差分析结果（±s）

表3　CYP2C19的主因素单方差分析结果（±s）

注：与WT比较， P＜0.05；与HE比较， P＜0.05。

参数t1/2（h）C L / F（L / h）Cmax（n g / m L）A U C0-36（n g · h / m L）A U C0-∞（n g · h / m L）W T 6 . 3 ± 3 . 4 6 0 . 1 ± 2 3 . 5 1 2 3 9 . 8 ± 5 4 7 . 1 3 2 2 3 . 0 ± 9 6 9 . 8 3 6 7 0 . 4 ± 1 0 1 7 . 5 H E 6 . 2 ± 2 . 9 4 5 . 4 ± 1 9 . 6 1 3 5 2 . 1 ± 4 8 5 . 5 4 6 5 7 . 7 ± 1 6 2 8 . 1 4 8 5 5 . 1 ± 1 7 2 7 . 6 H O 5 . 9 ± 2 . 4 2 8 . 4 ± 6 . 8 1 8 0 7 . 5 ± 6 0 5 . 0 7 4 9 1 . 1 ± 2 2 4 5 . 5 7 7 6 2 . 3 ± 2 4 7 1 . 3 P值0 . 6 5 2 0 . 0 4 0 0 . 3 7 1 0 . 0 2 0 0 . 0 1 8

对CYP2C19的CL/F，AUC0-36，AUC0-∞用Scheffe法进行多重比较，结果显示，CYP2C19突变纯合子的AUC0-36及AUC0-∞值显著高于野生组及突变杂合组（P＜0.05）；而CYP2C19突变纯合子的CL/F值则明显低于野生组（P＜0.05）。详见表4。

表4　CYP2C19的CL/F、AUC0-36及AUC0-∞的多重比较

3　讨论

药代动力学是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄的规律，并运用数学原理和方法阐述血药浓度随时间变化的规律的一门学科［8］。了解和掌握药代动力学，对于提高药物疗效和安全性具有重要的临床意义，可指导给药剂量、给药时间、给药途径的选择，规避与其他药物的不良相互作用［9］。

研究证实，影响药物代谢的因素中，20%～95%的是由基因引起，非基因因素的作用是可变的，但遗传因素却恒定地影响人一生对药物的反应［10］。基因多态性在生物群体中十分普遍，由于基因水平的变异，人体对疾病、毒物的易感性与耐受性各有不同，因此对药物治疗的反应也不相同［11］。伏立康唑主要依赖P450酶系中的CYP3A5和CYP2C19进行代谢，已有文献报道，CYP3A5＊3会对多种药物的代谢产生影响［12］，东方人体内CYP2C19慢代谢型的发生率为13%～25%［13］，这种变异的频率是否足以导致酶功能改变而影响伏立康唑的药代动力学值得探讨。

本研究中用主效应模型单独分析CYP3A5和CYP2C19的t1/2，CL/F，Cmax，AUC0-36和AUC0-∞。CYP3A5不同基因型伏立康唑的药代动力学参数均无统计学差异，这与国外的研究结果相同［14］；CYP2C19不同基因型的t1/2和Cmax无显著性差异，而CL/F，AUC0-36，AUC0-∞有显著性差异，与国外相关报道结果一致［15］。对CYP2C19的CL/F，AUC0-36，AUC0-∞用Scheffe法进行多重比较，结果显示，CYP2C19突变纯合型的AUC0-36及AUC0-∞值显著高于野生型和突变杂合型；而CYP2C19突变纯合型的CL/F值则明显低于野生型。因此，CYP2C19的基因多态性对伏立康唑的药代动力学有较明显的影响，而CYP3A5的基因多态性对伏立康唑的药代动力学则无显著影响。

由于本研究样本量较少，CYP3A5和CYP2C19基因多态性对伏立康唑药代动力学影响的研究还不够全面，尚需增大样本量研究，以为临床的用药提供更准确的依据。

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Influence of Gene Polymorphisms of Cytochrome P4503A5 and Cytochrome P4502C19 on the Pharmacokinetics of Voriconazole

Huang Jinmei1，Chen Guixiang2，Li Zhiping1，Yuan Jiao1
（1.Dongguan Fifth People′s Hospital，Dongguan，Guangdong，China523900；2.Dongguan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Dongguan，Guangdong，China523125）

ObjectiveToanalyze the influence of gene polymorphism of cytochrome P4503A5（CYP3A5）and CYP2C19 on the pharmacokinetics of voriconazole.M ethodsBy RFLP-PCR method，CYP3A5，CYP2C19 whole blood genotyping was carried out on 20 healthy male volunteers.All volunteers took a single oral dose of voriconazole tablets 200 mg，and the liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS）of plasma concentrations of volunteers at various points was determined，and DAS 2.0 software was used for calculating the pharmacokinetic parameters of drugs.Main effects model was used with a separate analysis on the half-life period（t1/2），the apparent clearance（CL/F），peak plasma concentration（Cmax），area under the curve at 0～36 h drug（AUC0-36）and The total area under the curve（AUC0-∞）of CYP3A5 and CYP2C19.ResultsDifferent CYP3A5 genotypes showed no significantly difference in pharmacokinetic parameters of voriconazole（P＞0.05）；different CYP2C19 genotypes showed no significant difference ont1/2，Cmax（P＞0.05），whileCL/F，AUC0-36andAUC0-∞showed significant differences（P＜0.05）；multiple comparison method onCL/F，AUC0-36，AUC0-∞Scheffeof CYP2C19showed，AUC0-36andAUC0-∞valuesof CYP2C19mutationsweresignificantlyhigher than homozygous wild group and heterozygous mutation group（P＜0.05），whileCL/F value of CYP2C19 mutant homozygotes was significantly lower than wild group（P＜0.05）.ConclusionGene polymorphism of CYP2C19 has a significant effect on voriconazole pharmacokinetic process；while gene polymorphism of CYP3A5 has no obvious influence on voriconazole pharmacokinetic process.

cytochrome P4503A5；cytochrome P4502C19；gene polymorphism；voriconazole；pharmacokinetics

R969．1；R978．5

A

1006－4931（2016）16－0063－04

（2016－02－10；

2016－04－29）