秦皮提取物及秦皮甲素对大鼠类风湿关节炎的保护作用

汤丽芝，史亚军，刘继平，郭东艳，刘景楠

（陕西中医药大学，陕西咸阳712046）

秦皮提取物及秦皮甲素对大鼠类风湿关节炎的保护作用

汤丽芝，史亚军，刘继平，郭东艳，刘景楠

（陕西中医药大学，陕西咸阳712046）

目的探讨秦皮提取物及秦皮甲素对大鼠类风湿关节炎的保护作用，比较秦皮提取物与秦皮甲素的抗炎效果。方法分别采用角叉菜胶和弗氏完全佐剂制备大鼠急性关节炎和类风湿关节炎模型，并给予秦皮提取物和秦皮甲素干预后，测量大鼠足厚度、体重变化，并记录关节评分，酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定大鼠血浆白细胞介素1 （IL-1 ）、肿瘤坏死因子- （TNF- ）、丙二醛（MDA）水平及超氧化物歧化酶（SOD）活性变化。结果与空白组比较，2种炎症模型大鼠模型组的IL-1 ，TNF- ，MDA水平显著上升，SOD活性显著下降（P＜0.05）；与模型组比较，在2种炎症模型中，秦皮提取物组和秦皮甲素组IL-1 ，TNF- 含量均显著降低（P＜0.05）；在角叉菜胶模型中，秦皮甲素在致炎1，2 h表现出抑制作用（P＜0.05），秦皮提取物对SOD活力有显著影响（P＜0.05），秦皮甲素组在降低大鼠TNF- 水平上较秦皮提取物组显著（P＜0.05）；在佐剂模型中，秦皮提取物组和秦皮甲素组MDA含量显著降低（P＜0.05），秦皮提取物组关节评分较低（P＜0.05），秦皮甲素组在降低IL-1 水平上较秦皮提取物组更显著（P＜0.05）。结论秦皮提取物及秦皮甲素对类风湿关节炎有一定的保护作用，秦皮甲素可能为秦皮的主要抗炎物质，其作用机制可能与调节IL-1 和TNF- 水平有关。

秦皮提取物；秦皮甲素；类风湿关节炎；角叉菜胶；弗氏完全佐剂

类风湿关节炎（RA）是一种以关节及其周边组织病变为主的多发性、对称性、慢性全身性自身免疫疾病，目前西医并无有效的手段和特效药物进行治疗，只能通过控制关节及其他组织的炎症，修复关节损伤来缓解病情。秦皮是陕西道地药材，植物基源丰富，《神农本草经》记载其“主风寒湿痹，洗洗寒气，除热，目中青翳白膜”，现代临床主要用于治疗多种炎症、细菌性痢疾等［1-3］。秦皮甲素是秦皮主要的化学成分，具有抗炎镇痛、免疫调节等作用［4-5］。本研究中分别采用角叉菜胶和弗氏完全佐剂制备大鼠急性关节炎和类风湿关节炎模型，对秦皮提取物及秦皮甲素治疗类风湿关节炎的疗效进行初步评价，为进一步深入研究提供依据，现报道如下。

1　仪器、动物与试药

1.1仪器

AR1140万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多仪器＜上海＞有限公司）；iMark酶标仪18485（美国BIO-RAD公司）。

1.2动物

SD大鼠，108只，雄性，SPF级，体重（165±15）g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（陕）2012-003。

1.3试药

秦皮饮片（陕西兴盛德药业有限责任公司，批号为20150901），经陕西中医药大学生药教研室胡本祥教授鉴定；万通筋骨片（通化万通药业股份有限公司，批号为150805N）；阿司匹林肠溶片（辰欣药业股份有限公司，批号为BJ27748）；λ-角叉菜胶（美国Sigma公司，货号为22049-5G-F）；弗氏完全佐剂（美国Sigma公司，货号为F5881）；卡介苗冻干粉（陕西生物制品研究所）；秦皮甲素（陕西汉德兴生物科技有限公司，含量为98.45%）。白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均由南京森贝伽生物科技有限公司提供。

2　方法与结果

2.1方法

2.1.1造模与给药

角叉菜胶模型［6-7］：SD大鼠适应性喂养7 d后，随机分为6组，即空白组、模型组、秦皮甲素组、秦皮提取物组、阿司匹林组、万通筋骨组，各8只。称重并按以下剂量给予λ-角叉菜胶，秦皮甲素组0.10 g/kg（折合生药量7.2 g/kg），秦皮提取物组7.2 g/kg（生药量），阿司匹林组0.225 g/kg（去薄膜包衣），万通筋骨组0.3 g/kg（去薄膜包衣），模型组和空白组灌胃10 mL/kg生理盐水，每天灌胃1次，连续7 d。末次灌胃1 h后，除空白组外，其余大鼠右足趾部皮下注射0.1 mL的1%角叉菜胶溶液致炎，空白组注射0.1 mL生理盐水，标记右足测量部位，分别在致炎前与致炎后1，2，3，4，5 h测量右足厚度，计算足肿胀度。足肿胀度=致炎后足厚度-正常足厚度。

佐剂模型［8-9］：SD大鼠适应性喂养7 d后，随机分为6组，即空白组、模型组、秦皮甲素组、秦皮提取物组、阿司匹林组、万通筋骨组，各10只。给空白组大鼠右足趾注射0.1 mL生理盐水，其余大鼠注射9 mg/mL的弗氏完全佐剂0.1 mL致炎，致炎后第8天开始灌胃，连续灌胃2周，给药剂量同角叉菜胶模型项下方法。在末次灌胃后记录大鼠全身病变的四肢关节评分：无红肿计为0分，小趾关节红肿计为1分，趾关节和足趾肿胀计为2分，踝关节下足肿胀计为3分，踝关节内全部足趾肿胀计为4分，最高可计16分。体重增长率=（末次给药体重-给药前体重）/给药前体重×100%。

2.1.2样本采集及指标测定

两组均在试验结束后麻醉大鼠，取血，离心血样，取上清液，放入4℃冰箱中保存，备用。采用ELISA法严格按照试剂盒说明书测定IL-1β，TNF-α，MDA含量及SOD活性。

2.1.3统计学处理

2.2结果

2.2.1对角叉菜胶模型大鼠足肿胀的影响

与模型组比较，秦皮甲素组在致炎后1，2 h，表现出对足肿胀的抑制作用（P＜0.05）；秦皮提取物组及万通筋骨组在致炎后5 h出现抑制作用（P＜0.05）；阿司匹林组在致炎后1，2，3，4，5 h均有明显的抑制效果（P＜0.05）。详见表1。

表1　各组给药后对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响（±s，cm，n=8）

表1　各组给药后对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响（±s，cm，n=8）

注：与模型组比较， P＜0.05。表3同。

组别模型组阿司匹林组万通筋骨组秦皮甲素组秦皮提取物组1 h 0 . 1 8 ± 0 . 0 2 0 . 1 0 ± 0 . 0 4 0 . 1 5 ± 0 . 0 5 0 . 1 2 ± 0 . 0 4 0 . 1 5 ± 0 . 0 4 2 h 0 . 3 0 ± 0 . 0 6 0 . 2 0 ± 0 . 0 7 0 . 2 7 ± 0 . 0 8 0 . 2 1 ± 0 . 0 8 0 . 2 5 ± 0 . 0 5 3 h 0 . 3 7 ± 0 . 0 7 0 . 2 1 ± 0 . 0 7 0 . 3 3 ± 0 . 0 9 0 . 3 0 ± 0 . 0 8 0 . 3 2 ± 0 . 0 7 4 h 0 . 3 5 ± 0 . 0 8 0 . 2 2 ± 0 . 0 5 0 . 3 0 ± 0 . 0 6 0 . 2 8 ± 0 . 0 7 0 . 2 9 ± 0 . 0 7 5 h 0 . 3 3 ± 0 . 0 7 0 . 2 3 ± 0 . 0 4 0 . 2 4 ± 0 . 0 6 0 . 2 8 ± 0 . 0 7 0 . 2 4 ± 0 . 0 7

2.2.2对角叉菜胶模型大鼠血浆IL-1β，TNF-α，MDA，SOD的影响

与模型组比较，空白组大鼠的IL-1β，TNF-α，MDA水平均明显降低，而SOD活性显著升高（P＜0.05），表明角叉菜胶诱导大鼠足肿胀模型成功；与模型组比较，秦皮甲素组大鼠的IL-1β和TNF-α水平均显著降低（P＜0.05），秦皮提取物组大鼠的IL-1β和TNF-α水平均显著降低，而SOD活性显著升高（P＜0.05）；与两组阳性药物组比较，秦皮甲素组大鼠的TNF-α水平较万通筋骨组降低显著（P＜0.05），秦皮提取物组大鼠的TNF-α水平较阿司匹林组显著升高（P＜0.05），且IL-1β水平较万通筋骨组显著降低（P＜0.05）；秦皮甲素组大鼠的TNF-α水平降低较秦皮提取物组显著（P＜0.05）。详见表2。

2.2.3佐剂模型大鼠关节炎评分和体重增长率

与模型组比较，阿司匹林组与秦皮提取物组关节炎评分明显降低（P＜0.05）；万通筋骨组体重增长最显著（P＜0.05）。详见表3。

2.2.4佐剂模型大鼠血浆IL-1β，TNF-α，MDA，SOD的含量

与模型组比较，空白组大鼠的IL-1β，TNF-α，MDA水平均降低，而SOD活性升高（P＜0.05），表明佐剂模型大鼠类风湿关节炎模型成功。与模型组比较，秦皮甲素组和秦皮提取物组大鼠血浆IL-1β，TNF-α，MDA水平均显著降低（P＜0.05），而SOD活性差异不明显（P＞0.05）；与两组阳性药物组比较，秦皮甲素组大鼠的IL-1β水平较阿司匹林组及万通筋骨组降低均更显著（P＜0.05），秦皮提取物组大鼠的MDA水平较阿司匹林组降低显著（P＜0.05），秦皮甲素组IL-1β水平降低较秦皮提取物组更显著（P＜0.05）。详见表4。

表2　各组角叉菜胶模型大鼠血浆IL-1 ，TNF- ，MDA，SOD比较（±s，n=8）

表2　各组角叉菜胶模型大鼠血浆IL-1 ，TNF- ，MDA，SOD比较（±s，n=8）

注：与模型组比较， P＜0.05；与阿司匹林组比较， P＜0.05；与万通筋骨组比较，#P＜0.05；与秦皮提取物组比较， P＜0.05。表4同。

组别空白组模型组阿司匹林组万通筋骨组秦皮甲素组秦皮提取物组I L -1 （p g / m L）1 2 . 0 6 ± 1 . 1 8 2 8 . 7 4 ± 1 . 9 8 2 0 . 3 2 ± 3 . 1 6 2 3 . 2 9 ± 2 . 6 0 2 3 . 2 2 ± 4 . 3 5 1 8 . 3 2 ± 6 . 1 7#T N F - （p g / m L）9 8 . 8 9 ± 5 . 8 8 1 4 1 . 1 5 ± 4 . 3 8 1 1 9 . 4 9 ± 5 . 5 4 1 4 1 . 8 6 ± 7 . 7 8 1 2 0 . 5 5 ± 7 . 8 6#1 3 4 . 2 2 ± 4 . 0 5 M D A（n m o l / m L）6 . 3 9 ± 0 . 5 3 7 . 2 5 ± 0 . 4 0 6 . 7 8 ± 0 . 4 6 6 . 7 7 ± 0 . 3 6 7 . 0 8 ± 0 . 3 6 7 . 1 7 ± 0 . 4 9 S O D（U / m L）1 5 7 . 2 8 ± 6 . 2 4 1 5 0 . 1 3 ± 3 . 5 3 1 5 6 . 1 1 ± 7 . 7 8 1 5 4 . 9 4 ± 7 . 9 7 1 5 4 . 2 9 ± 8 . 9 9 1 5 9 . 3 6 ± 8 . 4 1

表3　佐剂模型大鼠关节炎评分与体重增长率比较（n=10）

表4　佐剂模型大鼠血浆IL-1 ，TNF- ，MDA，SOD的含量比较（±s，n=10）

表4　佐剂模型大鼠血浆IL-1 ，TNF- ，MDA，SOD的含量比较（±s，n=10）

组别空白组模型组阿司匹林组万通筋骨组秦皮甲素组秦皮提取物组I L -1 （p g / m L）8 . 9 7 ± 1 . 2 8 2 3 . 6 2 ± 2 . 9 2 1 9 . 2 9 ± 1 . 5 7 1 8 . 8 0 ± 1 . 7 9 1 6 . 7 2 ± 1 . 1 4#2 0 . 0 4 ± 2 . 0 3 T N F - （p g / m L）9 1 . 1 6 ± 1 0 . 4 2 1 8 4 . 0 4 ± 8 . 8 8 1 6 3 . 2 4 ± 1 0 . 6 7 1 6 5 . 1 8 ± 8 . 8 4 1 6 4 . 1 6 ± 1 0 . 4 2 1 6 1 . 7 1 ± 9 . 3 0 M D A（n m o l / m L）6 . 4 4 ± 0 . 5 4 9 . 6 0 ± 2 . 1 5 7 . 8 9 ± 1 . 0 8 6 . 5 6 ± 1 . 0 2 7 . 0 6 ± 1 . 4 4 6 . 9 3 ± 0 . 5 4 S O D（U / m L）1 0 8 . 1 0 ± 4 . 9 6 9 7 . 3 1 ± 6 . 2 9 1 0 7 . 7 9 ± 8 . 4 5 1 1 1 . 2 6 ± 3 . 3 6 9 9 . 2 4 ± 5 . 9 1#9 8 . 3 1 ± 3 . 4 6#

3　讨论

类风湿关节炎是基于炎症刺激的滑膜细胞增殖，进而导致具有侵袭性的血管翳形成，血管翳的扩张可促进软骨和骨的破坏，导致关节功能丧失的自身免疫疾病［10］。目前，临床并无有效的治愈药物，控制关节及其他组织的炎症以缓解症状是重要治疗手段。

TNF-α和IL-1β是促进类风湿关节炎滑膜炎发生的重要炎性因子。在类风湿关节炎中，TNF-α主要产生于其滑膜中的滑膜巨噬细胞，可刺激纤维母细胞增殖及淋巴细胞的活性［11］。IL-1β在免疫调节及炎症进程中具有重要影响，与类风湿关节炎的活动性和组织形态学特征密切相关［12］。阻断TNF-α和IL-1β对治疗类风湿关节炎具有重要意义。MDA是脂质过氧化重要产物，其损伤能加速膜损伤，通过测定MDA可间接反映膜系统受损程度。SOD是体内重要的氧化酶，能清除氧自由基，是对抗氧自由基损伤的首要物质。阿司匹林和万通筋骨片治疗类风湿关节炎临床疗效确切。本研究中选用TNF-α和IL-1β水平对秦皮在非特异性和特异性关节炎模型的抗炎效果进行评价，选用MDA水平和SOD活性对秦皮保护机体因炎症导致的氧化损伤情况进行评价，并分别与治疗类风湿关节炎的阿司匹林和万通筋骨片进行对比。

本研究中，角叉菜胶模型研究结果显示，秦皮甲素和秦皮提取物能在一定程度上抑制试验性关节炎的炎性反应，秦皮甲素在初期对炎症表现出明显的抑制作用，秦皮提取物可提高SOD活性，降低氧自由基对机体带来的损伤。秦皮甲素与阿司匹林的抗炎效果相当，较万通筋骨片抗炎效果略强。佐剂关节炎模型是一种变态炎症模型，是由迟发性超敏反应引起的全身性病变，常作为类风湿关节炎模型进行研究。该模型研究结果显示，秦皮提取物和秦皮甲素对试验性类风湿关节炎的发生具有抑制作用，并在一定程度上降低脂质过氧化物对机体的影响。秦皮甲素的抗炎效果优于秦皮提取物，与阿司匹林、万通筋骨片效果相当。在试验过程中，秦皮甲素组和秦皮提取物组大鼠精神状况较其他组活跃，且模型组与万通筋骨组大鼠脾脏部分发生粘连。

综上所述，秦皮提取物和秦皮甲素对类风湿关节炎具有一定的保护作用，秦皮甲素可能为秦皮的主要抗炎物质，其作用机制可能与调节IL-1β和TNF-α水平有关。

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Protective Effects of Fraxini Cortex Extract and Aesculin on Rats with Rheumatoid Arthritis

Tang Lizhi，Shi Yajun，Liu Jiping，Guo Dongyan，Liu Jingnan
（Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi，China712046）

ObjectiveTo investigate the effect of fraxini cortex extract and aesculin on rheumatoid arthritis of rats and compare the anti-inflammatory effect of fraxini cortex extract and aesculin.M ethodsTwo model groups of arthritis rats induced by adjuvant which were similar to arthritis rheumatic and acute rats induced by carrageenan which were similar to acute arthritis were made and treated with fraxini cortex extract.The paw thickness，weight changes were measured，and the joint score were recorded；the changes of IL-1β，TNF-α，MDA，and SOD in serum were detected by ELISA.ResultsCompared with the blank group，the levels of IL-1β，TNF- ，and MDA in the two model groups were significantly increased，and the activity of SOD significantly reduced（P＜0.05）；the contents of IL-1β and TNF-α fraxini in the cortex extract and aesculin group were decreased significantly（P＜0.05）；the aesculin showed inhibition effect on proinflammatory after 1，2 h（P＜0.05），fraxini cortex extract showed significant effect on SOD（P＜0.05），and aesculin showed better effect on reducing the level of TNF-α than fraxini cortex extract in the carageen model（P＜0.05）.In the adjuvant model，the MDA content decreased significantly in both groups（P＜0.05），the aesculin group had lower joint score（P＜0.05），and aesculin showed better effect on reducing the level of IL-1β than fraxini cortex extract（P＜0.05）.ConclusionFraxini cortex extract and aesculin has certain therapeutic effect on rheumatoid arthritis，and aesculin may be a major anti-inflammatory.Its mechanism may be associated with IL-1β and TNF-α levels.

fraxini cortex extract；aesculin；RA；carrageenan；freund′s complete adjuvant

R285．5；R282．71

A

1006－4931（2016）16－0027－04

国家中医药管理局中医药行业科研专题项目，项目编号：201507002；陕西省中药制药重点学科资助项目，项目编号：1999。

汤丽芝，女，在读硕士研究生，研究方向为中药制剂，（电子信箱）270662988@qq.com；史亚军，男，博士研究生，教授，研究方向为中药新剂型、新技术，本文通讯作者，（电子信箱）328573751@qq.com。

（2016－05－01）