X连锁显性遗传性原卟啉症一家系及ALAS2基因突变分析

王涛 董琦 徐晨琛 周细平 刘跃华 王宏伟 孙秋宁 晋红中 郑和义欧阳云淑 栗春佳 陈蓉蓉 张宏冰 刘雅萍 王永伟 聂广军

100730北京，中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院皮肤科（王涛、董琦、徐晨琛、周细平、刘跃华、王宏伟、孙秋宁、晋红中、郑和义），超声医学科（欧阳云淑）；中国医学科学院 北京协和医学院 基础研究所生理和病理生理系、医学分子生物学国家重点实验室（栗春佳、陈蓉蓉、张宏冰），遗传学系（刘雅萍）；国家纳米科学中心（王永伟、聂广军）

X连锁显性遗传性原卟啉症一家系及ALAS2基因突变分析

王涛 董琦 徐晨琛 周细平 刘跃华 王宏伟 孙秋宁 晋红中 郑和义欧阳云淑 栗春佳 陈蓉蓉 张宏冰 刘雅萍 王永伟 聂广军

100730北京，中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院皮肤科（王涛、董琦、徐晨琛、周细平、刘跃华、王宏伟、孙秋宁、晋红中、郑和义），超声医学科（欧阳云淑）；中国医学科学院 北京协和医学院 基础研究所生理和病理生理系、医学分子生物学国家重点实验室（栗春佳、陈蓉蓉、张宏冰），遗传学系（刘雅萍）；国家纳米科学中心（王永伟、聂广军）

目的报道中国人X连锁显性遗传性原卟啉症一家系，并对其5⁃氨基酮戊酸合成酶2（ALAS2）基因突变进行研究。方法收集该家系成员资料，进行临床调查。用二代测序方法检测后再行Sanger测序，测定该家系中患病者及部分表型正常者ALAS2致病基因。用皮肤镜观察皮肤卟啉皮损，根据Fotofinder系统和甚高频皮肤超声系统评估皮肤卟啉症的光损伤严重程度，对该家系成员做肝胆B超检查，同时检测血液学改变。结果该家系中所有患者X染色体的1706号到1709号碱基发生AGTG缺失，导致转录时移码突变，最终导致翻译得到的ALAS2酶C端19、20个残基替换或缺失，ALAS2酶活性升高。XLDPP患者皮肤光损伤显著，肝胆可出现卟啉损伤，随年龄增加而加重，可出现贫血和铁过载。结论X染色体1706⁃1709碱基AGTG缺失突变可能是该ALDPP家系患者的发病原因。

卟啉病，红细胞生成性；遗传性疾病，X连锁；DNA突变分析；5⁃氨基酮戊酸合成酶2基因；光老化

X连锁显性遗传性原卟啉症［X⁃linked dominant protoporphyria（XLDPP），MIM no.300752］是一种自幼发病的原卟啉症，由5⁃氨基酮戊酸合成酶2（5⁃aminolevulinic acid synthetase 2，ALAS2）C决定区突变引起的功能改变所致，该酶是血红蛋白合成途径中第1个酶的红细胞特异性亚型［1］。临床上出现儿童甚至新生儿期发病且持续终身的光敏感，部分患者出现肝病。我们针对一个XLDPP家系进行二代测序（next generation sequencing，NGS）发现ALAS2（1606⁃1609，ΔAGTG）缺失突变，并通过Sanger测序验证确诊；同时还对XLDPP的临床特征等进行描述。经中国医学科学院医学信息研究所查新报告显示:国内外检索未见报道中国人X连锁显性遗传性原卟啉症一家系，并对其ALAS2基因突变进行研究的文献报道。本文为首例报道。

资料与方法

一、病历资料

先证者男，7岁。因面部多发瘢痕、日晒后痒痛7年来诊。父母诉患儿自出生后，外出晒太阳数小时后出现面部双手等曝光部位红肿、痒痛，搔抓后出现瘢痕和结痂。避光后痒痛可缓解，但瘢痕不能消退。无红尿、畏光；牙齿不洁净，尚整齐。皮肤科检查：面部、耳廓、双手背见显著增厚的红斑、斑片，伴有萎缩和增厚的痘疮样瘢痕，面部见抓痕和血痂，鼻背部点状虫蚀状凹陷性瘢痕，口周放射纹。见图1。

图1 先证者面部、耳廓见显著增厚的红斑、斑片，伴有萎缩和增厚的痘疮样瘢痕，面部见抓痕和血痂，口周放射纹

对该先证者所在家系进行调查，绘制家系图（图2）。先证者母亲、姨妈、外祖母、曾外祖母、表姨和该表姨1个儿子均有类似症状。先证者母亲皮肤肤色基本正常，诉有日晒后面部和双手的痒痛，未起过水疱。姨妈出现过光暴露后面部轻度刺痛，无瘢痕和水疱的病史；外祖母、外姨祖母、表姨皮损均表现为褐黄色肤色，面部和手背皮肤增厚，纹理明显增粗。先证者一表哥16岁，诉幼时与先证者症状和体征类似，目前曝光部位肤色深，面部弥漫性增厚和萎缩性瘢痕，但无日晒后痒痛感。

二、方法

在该家系成员签署知情同意书后，收集该家系成员（Ⅱ2，Ⅱ8，Ⅲ1，Ⅲ2，Ⅲ3，Ⅲ4，Ⅳ1，Ⅳ2，Ⅳ3）外周血，行实验室检查，包括血常规、生化、网织红细胞、转铁蛋白等。对该家系以上成员行肝胆B超检查、皮肤镜检查和甚高频（very high frequency，VHF）皮肤B超检查，并用Fotofinder系统行皮肤老化评估［2］。对先证者皮损活检，行HE染色和过碘酸希夫（PAS）染色。留取先证者（Ⅳ1）、先证者父母（Ⅲ1，Ⅲ2）、弟弟（Ⅳ2）和姨妈（Ⅲ3）的外周血，提取基因组DNA，行NGS和Sanger测序，用家族中未患病者（Ⅲ1和Ⅳ2）和100例健康人做对照。

结 果

一、血液学检查

先证者、患病表哥红细胞内游离原卟啉升高。患病者（Ⅱ2，Ⅱ8，Ⅲ2，Ⅲ3，Ⅲ13，Ⅳ1，Ⅳ3）存在不同程度的铁缺乏（包括血清铁、铁饱和度、转铁蛋白饱和度、铁蛋白均下降）。

二、肝胆B超检查

该XLDPP家系中，先证者的外祖母（Ⅱ2）和表姨（Ⅲ13）均已行胆囊切除术。表哥（Ⅳ3）胆囊增大，胆囊多发息肉，最大直径0.23 cm。

三、皮肤镜检查结果

图2 X连锁显性遗传性原卟啉症家系图

均选择鼻背部瘢痕处行皮肤镜检查：先证者母亲（Ⅲ2）：淡红斑片，网状白斑。先证者（Ⅳ1）：棕黄色背景，可见大量毛囊角栓，毛囊周围可见白晕，散在褐色点状色素沉着，可见明显的线状及网状白斑，部分区域可见破溃、结痂。先证者患病表哥（Ⅳ3）：棕黄色背景、大量的一致性分布的褐色点状色素沉着、囊泡状色素沉着，明显的线状及网状白斑，散在棕色斑片。

四、VHF皮肤B超检查结果

先证者面部皮肤表皮层增厚明显，真皮层内弥漫性低回声，占位感不明显，形态不规则。

五、Fotofinder光老化评估

根据Fotofinder系统对先证者面部评分，结果显示：毛孔粗大程度＞14%的同龄人；紫外线损伤程度＞85%同龄人；面部发红程度＞58%同龄人；皱纹严重程度＞83%同龄人；皮肤光滑度＜84%同龄人。

六、皮肤组织病理表现

取先证者右侧颞上部暴露日光处瘢痕组织行病理检查，结果显示：表皮内见空泡化细胞，局灶性角化不全；真表皮交界处见多发的裂隙；真皮全层增厚，可见增生粗大的胶原纤维束，嗜碱性明显，真皮乳头层结构紊乱，见毛细血管扩张充血，血管增生明显。皮下脂肪未见异常，见图3。

七、测序结果

经NGS测序后Sanger测序验证，该家系中患病者X染色体的1706号～1709号碱基有AGTG的缺失突变（ALAS2 c.1706 ⁃1709delAGTG；g.26827_26830）。见图4。家系中未患病者以及正常对照者未见类似突变。

讨 论

图3 先证者右颞部曝光部位皮肤病理改变（HE×200） 表皮内见空泡化细胞，局灶性角化不全；真表皮交界处见多发的裂隙；真皮全层增厚，可见增生粗大的胶原纤维束，嗜碱性明显，真皮乳头层结构紊乱，见毛细血管扩张充血，血管增生明显

2008年XLDPP首次由Whatley等报道，目前世界上报道的病例不超过50例［1］，较为罕见。XLDPP主要是男性受累，患者常在曝光后数分钟内自觉皮肤出现针刺、烧灼、疼痛和瘙痒的感觉，并且出现红肿等光敏感为主要表现。儿童甚至婴儿期即可发病。较少出现水疱，但可因患者的搔抓出现结痂、糜烂等。很多患者皮肤曝光后，疼痛可超出曝光部位，且持续数小时甚至数日。光敏性常持续终身，最终患者因反复出现的急性发作出现慢性光损伤性改变，如苔藓化、皮肤如皮革状质地的假水疱、口周放射纹等，指甲扁平。杂合子女性患者可完全无症状，也可同男性一样受累严重。

目前发现导致XLDPP的ALAS2基因突变包括 c.1706⁃1709 delAGTG（p.E569GfsX24）、c.1699⁃1700delAT（p.M567EfsX2）、c.1642C ＞ T（Q548X）和c.1651⁃1677del（S551PfsX5），位于 11 号外显子［1，3］。本研究发现的突变是已知的c.1706⁃1709 delAGTG（p.E569GfsX24），为框移突变，影响ALAS酶的19⁃20C决定区残基，导致酶活性显著增加。本研究中，男性患者病变均较重，而女性患者皮损表现轻微，甚至无皮损，但年龄增大后，女性出现胆囊结石，甚至需要切除胆囊。男性患者较女性为重，这一现象可能与X染色体失活（lyonization）有关［4］。但胆囊病变与既往报道差异较大［5］，需进一步观察。

XLDPP诊断主要依靠明确的基因检测结果［1］。临床上主要与红细胞生成性原卟啉病（EPP）鉴别。表型严重的XLDPP患者体内原卟啉IX含量较红细胞生成性原卟啉病（EPP）更高，因此患者的痛性光敏反应以及肝损可能比EPP更重［6］。鉴别XLDPP与EPP非常重要，一个简单易行的方法是根据家系图受累患者进行分析，若患者家族人口多，那么明确诊断的可能性大。一般可以通过患病者性别的差异来初步判定，最终还需要致病基因的检测确诊。

图4 Sanger测序结果显示患者4个碱基缺失 上方为参考序列，下方为突变序列，红框示4个缺失的碱基（ALAS2 c.1706⁃1709，delAGTG）

我们使用皮肤镜评估光损伤的严重程度，从结果来看，XLDPP患者曝光处皮肤光损伤严重，一方面，可见到大量的毛囊角栓，另外可见到结痂，这些均在正常孩子面部很难见到。VHF也是最近几年来用于皮肤科诊断的一种新型手段，优点是无创，直观。我们用VHF进行XLDPP光损伤严重程度评分观察，因缺乏足够多的病例数以及对比研究，尚不能完全利用VHF来评估XLDPP以及其他卟啉症的严重程度。但对于面部这些皮肤活检等有创操作有禁忌的部位，将来可以尝试以皮肤镜和VHF作为辅助手段，评估XLDPP的损伤严重程度。

目前XLDPP治疗尚无良策。可以嘱咐患者进行避光，对患者家系进行遗传咨询，尤其是说明男性患病者较女性严重，对患者家属会有一定帮助。

［1］Whatley SD,Ducamp S,Gouya L,et al.C⁃terminal deletions in the ALAS2 gene lead to gain of function and cause X⁃linked dominant protoporphyria without anemia or iron overload［J］.Am J Hum Genet,2008,83（3）:408⁃414.DOI:10.1016/j.ajhg.2008.08.003.

［2］Levy JL,Trelles MA,Levy A,Besson R.Photography in dermatology:comparison between slides and digital imaging［J］.J Cosmet Dermatol,2003,2（3⁃4）:131⁃134.DOI:10.1111/j.1473⁃2130.2004.00081.x.

［3］Ducamp S,Schneider⁃Yin X,de Rooij F,et al.Molecular and functional analysis of the C⁃terminal region of human erythroid⁃specific 5⁃aminolevulinic synthase associated with X ⁃linked dominant protoporphyria（XLDPP）［J］.Hum Mol Genet,2013,22（7）:1280⁃1288.DOI:10.1093/hmg/dds531.

［4］Brancaleoni V,Balwani M,Granata F,et al.X⁃chromosomal inactivation directly influences the phenotypic manifestation of X⁃linked protoporphyria［J］.Clin Genet,2016,89（1）:20⁃26.DOI:10.1111/cge.12562.

［5］Ninomiya Y,Kokunai Y,Tanizaki H,et al.X⁃linked dominant protoporphyria:the first reported Japanese case［J］.J Dermatol,2016,43（4）:414⁃418.DOI:10.1111/1346⁃8138.13101.

［6］Seager MJ,Whatley SD,Anstey AV,et al.X⁃linked dominant protoporphyria:a new porphyria［J］.Clin Exp Dermatol,2014,39（1）:35⁃37.DOI:10.1111/ced.12202.

（本文编辑：尚淑贤）

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执行GB 3100/3101/3102-1993《国际单位制及其应用/有关量、单位和符号的一般原则/（所有部分）量和单位》的有关规定，具体执行可参照中华医学会杂志社编写的《法定计量单位在医学上的应用》第3版（人民军医出版社2001年出版）。凡是涉及人体及动物体内的压力测定，可以使用毫米汞柱（mmHg）或厘米水柱（cmH2O）为计量单位，但首次使用时应注明mmHg或cmH2O与kPa的换算系数（1 mmHg=0.133 kPa，1 cmH2O=0.098 kPa）。一般情况下，统一用L（升）作为表示人体检验组分浓度单位的分母，而不使用ml（毫升）、dl（分升）、mm3（立方毫米）等作分母。但当涉及高精度测试时，可以用ml、μl等作分母。在一个组合单位符号中，斜线不应多于1条。例如：mg/kg/d；应写为mg/（kg·d）或mg·kg-1·d-1。时间的表示方法：作为单位修饰词仅为数字时，天（日）用“d”，小时用“h”，分钟用“min”，秒用“s”。非单位时可用天、小时、分钟、秒。如：在描述第×天、第×小时、第×分钟，或每天、每小时、每分钟等时，均用汉字。表示离心加速作用时，应以重力加速度（g）的倍数形式表达。例如：6 000×g离心10 min。或者在给出离心机转速的同时给出离心半径，例如：离心半径8 cm，12 000 r/min离心10 min。

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本刊已开设“临床病例讨论”栏目，目的是给临床医生提供一个学习讨论与提高临床技能的园地，2015年第3期已刊出一篇。现向全国各大医院征集“临床病例讨论”稿。要求：所选病例应是皮肤性病学科的疑难病和少见病例，有较清晰的诊治过程、有明确的经验教训；或诊断明确，但治疗棘手，最终治疗成功或显效者。病例临床资料完整，能提供必要的实验室、影像学和组织病理等确诊证据（需提供临床皮损及治疗前后对比的图片，组织病理图片等）。写作格式：前言、病历资料、讨论（可以用病例讨论时依次发言的形式，也可以按临床医师诊疗思路，经过归纳，条理清楚地总结）、参考文献。文稿字数以3 000字左右为宜。欢迎踊跃投稿。

X⁃linked dominant protoporphyria:report of a pedigree and detection of ALAS2 gene mutations

Wang Tao,Dong Qi,Xu Chenchen,Zhou Xiping,Liu Yuehua,Wang Hongwei,Sun Qiuning,Jin Hongzhong,Zheng Heyi,Ouyang Yunshu,Li Chunjia,Chen Rongrong,Zhang Hongbing,Liu Yaping,Wang Yongwei,Nie Guangjun
Department of Dermatology,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100730,China（Wang T,Dong Q,Xu CC,Zhou XP,Liu YH,Wang HW,Sun QN,Jin HZ,Zheng HY）;Department of Ultrasound Medicine,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100730,China（Ouyang YS）;State Key Laboratory of Medical Molecular Biology,Department of Physiology and Pathophysiology,Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100730,China（Li CJ,Chen RR,Zhang HB）;Department of Medical Genetics,Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100730,China（Liu YP）;National Center for Nanoscience and Technology of China,Beijing 100190,China（Wang YW,Nie GJ）

ObjectiveTo report a pedigree with X⁃linked dominant protoporphyria（XLDPP）,and to detect 5⁃aminolevulinic acid synthetase 2（ALAS2）gene mutations in this pedigree.MethodsA clinical investigation was performed in a pedigree with XLDPP,and relevant data were collected from family members.A next⁃generation sequencing method was applied to screen possible mutation sites,and Sanger sequencing was performed to determine pathogenic gene mutations.Dermoscopy was conducted to observe skin lesions in the patients with XLDPP,and the Fotofinder system and very high frequency（VHF） ultrasound system were utilized to assess the severity of photodamage.Liver and gallbladder ultrasonography as well as blood examination were performed for all the family members.ResultsA deletion mutation,c.1706⁃1709 ΔAGTG,was detected in the ALAS2 gene on the X chromosomes of all the patients in this family,which led to replacement or loss of 19-20 C⁃terminal residues through transcriptional frameshifting,and eventually caused an increase in ALAS2 activity.In the patients with XLDPP,skin photodamage was relatively severe;protoporphyrin⁃induced hepatobiliary damage was observed and aggravated with age;anemia and iron deficiency occurred sometimes.ConclusionThe deletion mutation c.1706⁃1709 ΔAGTG of the ALAS2 gene may be the underlying cause of XLDPP in this pedigree.

Porphyria,erythropoietic;Genetic diseases,X⁃linked;DNA mutational analysis;5⁃Aminolevulinic acid synthetase 2 gene;Photoaging

Liu Yuehua,Email:yuehualiu@263.net

2016⁃04⁃25）

刘跃华，Email:yuehualiu@263.net

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.10.005