油樟叶总黄酮的提取及体外抗自由基活性

杜永华，敖光辉，魏琴，廖小龙，李雪辉

油樟叶总黄酮的提取及体外抗自由基活性

杜永华1，3，敖光辉2，*，魏琴1，*，廖小龙3，李雪辉3

（1.宜宾学院香料植物资源开发与利用四川省高校重点实验室，四川宜宾644000；2.内江师范学院，四川内江641112；3.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾644000）

研究油樟叶总黄酮的提取工艺及其体外抗自由基活性。在单因素试验基础上，采用均匀设计法优化油樟叶总黄酮的提取条件，并通过测定油樟叶总黄酮对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率研究其体外抗自由基活性。结果表明，提取油樟叶总黄酮的优化条件为乙醇体积分数60%、液料比34mL/g、浸泡时间0 min、回流提取时间122min、提取温度74℃，此条件下总黄酮提取量为42.09 mg/g。油樟叶总黄酮粗品表现出较强的体外抗自由基活性，其对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的半数清除浓度分别为2.81、3.35、3.21mg/mL。

油樟；黄酮；均匀设计；抗自由基

油樟［Cinnamomum longepaniculatum（Gamble）N. Chao］为樟科（Lauraceae）樟属（Cinnamomum）芳香植物，是我国特有树种［1］。油樟与药用植物香樟［Cinnamomum.camphora（Linn.）Presl］同属，枝叶均富含芳香油，是食品、香料、医药、日用和化工产品的重要原料来源［2］。香樟叶中除含有芳香油外，还含有黄酮、生物碱、甾醇、多糖等成分［3］，其黄酮和多糖成分含量较高，干叶片中含量分别达到39.68 mg/g和129.41 mg/g［4-5］，均有较强抗氧化活性［3，5］。前期研究表明，油樟叶提取芳香油后的残渣提取物具有抗菌［6-7］、抗炎［8］、镇痛［9］和抗癌［10］活性，脱油油樟叶含有黄酮、多糖、甾体、甙类等成分［11］，其中油樟叶总多糖的提取工艺及其抗自由基［12］和抗油脂氧化［13］活性已有研究，对油樟叶总黄酮的含量及其抗油脂氧化活性进行了研究［14］。但对油樟叶中总黄酮的提取工艺及抗自由基活性的研究鲜见道。本试验采用乙醇溶液提取脱油油樟叶中总黄酮成分，采用均匀设计法优选提取工艺，并探讨油樟叶总黄酮体外抗自由基活性，为油樟叶中黄酮成分的进一步研究与开发提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

油樟（C.longepaniculatum）叶：采摘于四川省宜宾市翠屏区邱场乡油樟种植基地；芦丁对照品（批号100080-200707，含量≥92.5%）：中国药品生物制品检定所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼［1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH］：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；LG-5A真空冷冻干燥机：上海市离心机械研究所有限公司。

1.2方法

1.2.1油樟叶预处理

采用水上蒸馏的方法，将油樟叶用水蒸气蒸馏3 h除去挥发油，残渣于60℃烘干，粉碎，取60目～80目油樟叶粉末，加石油醚（沸程30℃～60℃）65℃索氏抽提1 h脱脂，残渣60℃烘干，即得脱油油樟叶粉，待用。

1.2.2油樟叶总黄酮含量的测定

参考中国药典［15］，总黄酮含量采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法测定，精密称取芦丁标准品10.0 mg，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀。精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL至25 mL容量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加1.0 mol/L氢氧化钠溶液10.0 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，以试剂空白作参比溶液，于510 nm处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，芦丁质量浓度C（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，求得标准曲线回归方程为A=0.000 5C-0.017，R2=0.999 3。

精密吸取1.0 mL油樟叶总黄酮提取液至25 mL容量瓶中，加水至6.0 mL，按上述方法显色后在510 nm处测定吸光度值，根据标准曲线回归方程和稀释倍数计算样品溶液中的总黄酮含量，按下式计算总黄酮提取量：总黄酮提取量（mg/g）=提取液中黄酮含量mg/脱油油樟叶干粉质量g。

1.2.3油樟叶总黄酮的提取工艺流程

脱油油樟叶粉→加入乙醇溶液→浸泡→回流提取→过滤→滤液减压浓缩→总黄酮提取液

1.2.4单因素试验

1.2.4.1乙醇体积分数的影响

固定液料比15（mL/g）、浸泡60 min、提取温度70℃、回流提取时间120min，探讨乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）对总黄酮提取量的影响。

1.2.4.2液料比的影响

固定乙醇体积分数70%、浸泡60 min、提取温度70℃、回流提取时间120 min，探讨液料比（5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mL/g）对总黄酮提取量的影响。

1.2.4.3浸泡时间的影响

固定乙醇体积分数70%、液料比15 mL/g、提取温度70℃、回流提取时间120 min，探讨浸泡时间（0、30、60、90、120 min）对总黄酮提取量的影响。

1.2.4.4回流提取时间的影响

固定乙醇体积分数70%、液料比15（mL/g）、浸泡60 min、提取温度70℃、探讨回流提取时间（30、60、90、120、150 min）对总黄酮提取量的影响。

1.2.4.5提取温度的影响

固定乙醇体积分数70%、液料比15（mL/g）、浸泡60 min、回流提取时间120 min，探讨提取温度（50、60、70、80、90℃）对总黄酮提取量的影响。

1.2.5均匀设计法优化总黄酮提取工艺

在单因素试验基础上，选取乙醇体积分数、液料比、浸泡时间、回流提取时间和提取温度5个因素，参考方开泰［16］的方法选取U*10（108）表安排试验，对油樟总黄酮的提取工艺进行优化，并根据优化条件进行验证试验。

1.2.6油樟叶总黄酮抗自由基活性

以优化工艺制备油樟叶总黄酮提取液，减压浓缩至稠膏状，用体积分数为80%乙醇溶液醇沉过夜（除去多糖、蛋白、鞣质等杂质），过滤，滤液减压浓缩至膏稠状，真空冷冻干燥即得油樟叶总黄酮。按照杜永华等［12］的方法，采用1-二苯基-2-三硝基苦肼（DPPH）法测定总黄酮对DPPH自由基（DPPH·）清除活性，采用邻苯三酚自氧化法测定总黄酮对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除活性，采用Fenton法测定总黄酮对羟自由基（·OH）清除活性。

1.2.7数据分析

采用DPS7.05统计软件的多因子及互作项逐步回归模型分析均匀设计试验数据，采用数量型数据几值分析模型计算各测试药物对自由基的半数清除浓度（IC50）。

2　结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响

乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响见图1。

图1　乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响Fig.1Influence of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

由图1可知，油樟叶总黄酮提取量随着乙醇体积分数的增加呈先升高后下降的趋势，在乙醇体积分数为70%时，总黄酮提取量最高达32.30 mg/g，乙醇体积分数继续增加，其总黄酮提取量逐渐下降，乙醇体积分数达到90%时，总黄酮提取量急剧下降为21.40mg/g。根据相似相溶原理，油樟叶总黄酮的极性与体积分数为70%的乙醇溶液相近，在中等乙醇体积分数溶液中溶解度较高，在高乙醇体积分数溶液中溶解度较低，这与王先［3］用乙醇溶液提取樟树（C.camphora）中黄酮成分的结果趋势相似。可见，油樟叶黄酮与同属植物樟树的黄酮化合物极性相近。因此，70%为适宜乙醇体积分数。

2.1.2液料比对总黄酮提取量的影响

液料比对总黄酮提取量的影响见图2。

图2　液料比对总黄酮提取量的影响Fig.2Influence of solid-liquid ratio on the yield of total flavonoids

由图2可知，油樟叶总黄酮提取量随着液料比的增加而快速升高，当液料比达到30 mL/g时，总黄酮提取量最高达39.80 mg/g，再增加液料比时，总黄酮提取量缓慢下降。液料比小，提取液中油樟叶总黄酮过饱和，提取量降低。液料比增加，溶液与物料中的黄酮浓度差增大，由溶解平衡原理可知，黄酮提取量增加。但液料比过大，可能会改变提取液极性而降低部分黄酮成分的溶解性，使总黄酮提取量降低［17］；也可能因为液料比太大，提取液浓缩时带来的损失增加，提取量降低［18］。因此，30 mL/g为适宜液料比。

2.1.3浸泡时间对总黄酮提取量的影响

浸泡时间对总黄酮提取量的影响见图3。

图3　浸泡时间对总黄酮提取量的影响Fig.3Influence of immersion time on the yield of total flavonoids

由图3可知，油樟叶总黄酮提取量先随浸泡时间的增长而升高，浸泡30 min时总黄酮提取量最高达37.50 mg/g，此后总黄酮提取量缓慢下降，但总体差异不明显。因此，30 min为适宜浸泡时间。

2.1.4回流提取时间对总黄酮提取量的影响

回流提取时间对总黄酮提取量的影响见图4。

图4　回流提取时间对总黄酮提取量的影响Fig.4Influence of extraction time on the yield of total flavonoids

由图4可知，油樟叶总黄酮提取量随着回流提取时间的延长而呈现先增加后下降的变化规律，回流提取120 min时，总黄酮提取量最高达36.30 mg/g。提取时间短，黄酮类成分不能充分溶出；提取时间过长，部分黄酮类物质稳定性降低，也会随提取液浓缩而损失或分解，总黄酮提取量下降［19］。因此，选择120 min为适宜回流提取时间。

2.1.5提取温度对总黄酮提取量的影响

提取温度对总黄酮提取量的影响见图5。

图5　提取温度对总黄酮提取量的影响Fig.5Influence of extraction temperature on the yield of total flavonoids

由图5可知，油樟叶总黄酮提取量随着提取温度的增加而逐渐升高，温度达到80℃时，黄酮提取量最高达38.80 mg/g，继续升高温度，黄酮提取量反而下降。升高温度能增加黄酮类成分在提取液中的溶解度，但过高温度会破坏部分黄酮类化合物的稳定性，降低总黄酮提取量［20］。因此，以80℃为适宜提取温度。

2.2均匀设计对提取工艺的优化

在单因素试验基础上采用均匀设计试验优化油樟总黄酮的提取工艺，其结果见表1和表2。

由表1可知，油樟叶总黄酮提取量最高的试验组合为乙醇体积分数64%、液料比33 mL/g、浸泡时间0 min、回流时间108 min、提取温度78℃，总黄酮提取量40.43 mg/g。均匀设计试验各组数据经DPS统计软件的二次多项式逐步回归模型分析，得油樟叶总黄酮提取工艺参数回归方程：Y=-832.029 88-4.180 40X1+ 17.177 48X2+19.393 84X5-0.106 91X5X5-0.017 22X1X2+ 0.057 05X1X5-0.208 83X2X5-0.000 47X3X4，回归方程相关系数R=0.999 7，F=2 137.73，p=0.016 7＜0.05，Durbin-Watson统计量d=2.89，多元回归模型可用。在建立多元回归模型的同时进行通径分析，决定系数R2=0.999 9，剩余通径系数ρe=0.007 6，通径分析成立。

表1　均匀设计试验安排与结果Table 1Design matrix and results of uniformed design test

表2　各因素的显著性检验Table 2Significance of each variable term in the fitted regression equation for the yield of total flavonoids

由回归方程可知，X3和X4未入选方程，表明在试验所选因素水平范围内，浸泡时间（X3）和回流提取时间（X4）对油樟叶总黄酮提取量无显著影响，这与单因素试验结果相近。由表2偏相关系数大小可知，各因素对总黄酮提取量影响大小程度为：提取温度（X5）＞液料比（X2）＞乙醇体积分数（X1），其中提取温度和液料比的影响达到极显著水平（P＜0.01），乙醇体积分数的影响显著（P＜0.05）。乙醇体积分数与液料比（X1X2）、乙醇体积分数与提取温度（X1X5）、液料比与提取温度（X2X5）、浸泡时间与回流提取时间（X3X4）之间存在交互影响，其中乙醇体积分数与液料比的交互影响不显著（P＞0.05），其余的的交互影响极显著（P＜0.01）。浸泡时间与回流提取时间的交互作用对总黄酮提取量的影响较大。

根据多元回归模型，预测得到油樟叶总黄酮提取工艺的优化条件为：乙醇体积分数（X1）为60.00%，液料比（X2）为34.00 mL/g，浸泡时间（X3）为0.00 min，回流提取时间（X4）为121.66min，提取温度（X5）为73.50℃，总黄酮提取量预测值（Y）为43.65 mg/g。为便于操作将优化条件修正为：乙醇体积分数60%，液料比34 mL/g，浸泡时间0 min，回流提取时间122 min，提取温度74℃，进行3次平行验证试验，总黄酮平均提取量为42.09 mg/g，结果与预测值相近。可见，利用该优化工艺提取油樟叶总黄酮可行。目前，油樟同属植物香樟叶中黄酮类化合物的提取方法有传统醇提法、微波辅助提取法和超声波辅助提取法，其黄酮提取率不同，分别为39.68、41.30、10.44 mg/g［4，21-22］。可见，超声波辅助提取香樟叶总黄酮的提取率明显低于其它两种提取方法，但作者未对其引起较大差异的原因进行探讨，需进一步研究证实。油樟叶总黄酮的微波辅助提取和超声波辅助提取等方法，以及是否与传统醇提法存在差异也有待进一步研究。

2.3总黄酮粗品抗自由基活性

以优化工艺制备油樟叶总黄酮提取液，经除杂、浓缩和真空冷冻干燥得到黄色粉末状油樟叶总黄酮粗品，测得总黄酮粗品中总黄酮含量为394.3 mg/g。油樟叶总黄酮粗品对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基的清除活性见图6、图7和表3。

图6　油樟叶总黄酮对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基的清除率Fig.6ScavengingrateoftotalflavonoidsonDPPH·，O2-·and·OH

图7　抗坏血酸对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基的清除率Fig.7Scavenging rate of ascorbic acid on DPPH·，O2-·and·OH

表3　油樟叶总黄酮粗品对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基的半数清除浓度Table 3The half inhibit concentration of crude total flavonoids on DPPH·，O2-·and·OH

由图6和图7可知，油樟叶总黄酮和抗坏血酸对3种自由基的清除率都随浓度的增加而增加，其清除自由基能力具有一定的浓度依赖性。由表3可知，油樟叶总黄酮表现出一定的抗自由基作用，对DPPH·、O2-·和·OH的IC50分别为2.81、3.35、3.21 mg/mL，其对3种自由基的作用弱于抗坏血酸。王先［3］报道，香樟叶黄酮经大孔吸附树脂纯化后，所得精制黄酮纯度由38.15%提高到91.18%，其清除DPPH自由基的IC50为35.97 μg/mL，远高于油樟叶总黄酮粗品对DPPH自由基的清除作用。本试验所得油樟叶总黄酮粗品的纯度仅为39.43%，对油樟叶总黄酮粗品的纯化及其高纯品抗氧化活性需要进一步研究。

3　结论

采用均匀设计法对脱油油樟叶总黄酮的提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺为：乙醇体积分数60%，液料比34mL/g，浸泡时间0min，回流提取时间122min，提取温度74℃，此条件下油樟叶总黄酮提取量为42.09 mg/g。按该工艺制得油樟叶总黄酮粗品的黄酮含量为394.3 mg/g，并表现出一定的抗自由基作用，其对DPPH·、O2-·和·OH的IC50分别为2.81、3.35、3.21 mg/mL。

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Extraction Technology and Anti-radical Activities in vitro of Total Flavonoids from Cinnamomum longepaniculatum Leaves

DU Yong-hua1，3，AO Guang-hui2，*，WEI Qin1，*，LIAO Xiao-long3，LI Xue-hui3
（1.Key Lab of Aromatic Plant Resources Exploitation and Utilization in Sichuan Higher Education，Yibin University，Yibin 644000，Sichuan，China；2.Neijiang Normal University，Neijiang 641112，Sichuan，China；3.College of Life Science and Food Engineering，Yibin University，Yibin 644000，Sichuan，China）

The extraction technology and anti-radical activities in vitro of total flavonoids from Cinnamomum longepaniculatum leaves were investigated.The extraction conditions of total flavonoids were optimized using uniform design on the basis of single factor test，and the anti-radical activities were investigated by measuring the scavenging rate of total flavonoids on DPPH free radical，super oxide anion free radical and hydroxyl radical.Results showed that the optimum extraction conditions of total flavonoids from C.longepaniculatum leaves were ethanol concentration 60%，ratio of liquid-solid 34 mL/g，soaking time 0 min，extraction time 122 min，extraction temperature 74℃.Under such condition，the extraction rate of total flavonoids was 42.09 mg/g.The crude total flavonoids displayed good anti-radical activities with the half inhibition concentration（IC50）values of 2.81，3.35，3.21 mg/mL against DPPH free radical，super oxide anion free radical and hydroxyl radical，respectively.

Cinnamomum longepaniculatum；flavonoids；uniform design；anti-radical

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.009

四川省应用基础研究项目（2011JY0050）；四川省青年科技创新研究团队培育计划项目（2011JTD0035）；四川高校科研创新团队建设计划资助项目（14TD0031）

杜永华（1978—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：天然产物与功能活性研究。

敖光辉（1965—），男（汉），教授，研究方向：植物学；魏琴（1967—），女（汉），教授，博士，研究方向：植物资源开发利用。

2015-12-09